aFGF和其改构体对培养大鼠视网膜神经节细胞影响.pdfVIP

硕士研究生论文 aFGF及其改构体对培养大鼠视网膜神经节细胞的影响 前言 视神经损伤的原因主要有外伤、青光眼、视神经疾病等，它们所造成 的视功能损伤是不可逆的，给人们的工作、生活带来了许多不便。研究表 明这些病变的最后结局都指向RGCs的凋亡，因此，视神经损伤后对RGCs 的保护多年来都是研究的热点问题，其重点在于如何中止或防止凋亡的发 生及如何进行有效的修复再生。 aFGF广泛存在于多种神经外胚层和中胚层起源的组织(如大脑皮质、 下丘脑、垂体和视网膜等)，它是一种具有多方面功能的活性蛋白，不但可 以促进创伤修复，而且具有保护心肌、神经及局部缺血等促分裂及非促分 裂效应。采用免疫组化方法测出aFGF主要分布于运动神经元、感觉神经元、 基底前脑副交感神经元和黑质神经元等神经元的胞体、轴突与树突中¨1， 这表明aFGF对神经组织有极为重要的生物学作用。但是aFGF的促有丝分 裂活性有诱发肿瘤的风险心1，阻碍它在临床上的进一步应用。新型的MaFGF 定向去除了aFGF的促有丝分裂活性，保留其非促分裂活性，同时国内学者 的研究也表明，蛋白质改构后，MaFGF的神经保护能力仍然存在‘31。 本课题通过对大鼠视网膜神经节细胞的培养，观察了aFGF及MaFGF 对RGCs存活时间、数量的影响，及这种影响对其有丝分裂活性的依赖程 度。 硕士研究生论文 aFGF及其改构体对培养大鼠视网膜神经节细胞的影响 材料和方法 1．材料 cruz公司 科大学实验动物中心提供；Thy-I抗大鼠单克隆抗体由美国Santa 提供；二步法免疫组化检测试剂由北京中杉金桥生物技术有限公司提供； modified 液(Dulbecco’S Eagle’s 供；阿糖胞苷(cytosine 2．方法 2．1 RGC接种培养和实验方法 膜缘剪除角膜，去除晶体和玻璃体，然后钝性分离出神经层视网膜。用 钝头吸管吹打使之成为细胞悬液，行细胞计数，使细胞数为1×106个／ml。 将细胞悬液接种于已包备鼠尾胶的96孔板内，随机分为3天、5天、7天 6 硕十研究生论文 aFGF及其改构体对培养大鼠视网膜神经节细胞的影响 以抑制非神经细胞生长，48小时后，每一亚组分别加入DMEM(对照组)， 浓度分别为25 ng／ml、100 按上法加入相应量的aFGF及MaFGF以维持作用浓度。 2．2． 观察指标 记录RGsC存活时间。 2．2．2细胞免疫化学检查取培养第3天、5天、7天的细胞行抗大鼠 Thy-1单克隆抗体免疫细胞学检查，同时设立阴性对照组。方法：标本以磷 酸缓冲液(phosphatebuffered 育20min，滴加1：50 对照用PBS液。按二步法免疫组化检测试剂说明书要求，顺次加入试剂1 和试剂2。滴加辣根酶标记SP，3，3．二氨基联苯胺(3， 10)进行免疫阳性细胞计数，取其平 右4个方向随机选取4个高倍视野(20x 均值作统计学分析，并计算染色阳性细胞中有轴突生长细胞的百分率。 2．2．3MTT比色法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法) 10uL，继续在37C培养 5、7天的96孔培养板细胞加入5mg／mL的MTT 7 硕十研究生论文 aFGF及其改构体对培养大鼠视网膜神经节细胞的影响 箱内培养4h后离心弃上清，加入DMS0150|l 波长处在酶联免疫检测仪上测定吸光度A值(成活的细胞越多，所测A值 就越高)。 2．3．统计学处理