生物蛹虫草萃取物对登革、日本脑炎病毒之抑制作用.docVIP

臺北市第39屆中小學科學展覽會 作品說明書封面 科 別：生物（生命科學）科 組 別：高中 作品名稱：蛹蟲草萃取物對登革、日本腦炎 病毒之抑制作用 關 鍵 詞：蛹蟲草 、抗病毒作用、病毒 編 號： 作品名稱：蛹蟲草萃取物對登革、日本腦炎病毒之抑制作用 摘要： 此報告在研究保健食品蛹蟲草(Cordyceps militaris，或稱北冬蟲夏草、北蟲草)全草中的成分是否能夠抑制登革病毒或日本腦炎病毒。 我們採用的方法是用病毒感染中國蒼鼠的腎臟細胞。先以IFA(免疫螢光染色技術)觀察蛹蟲草萃取物對病毒感染細胞效能的影響，再以病毒效價(titer)測試方法觀察蛹蟲草萃取物是否影響病毒的數量或複製過程。 我們發現溶在60%酒精的蛹蟲草成分對登革病毒的複製功能，有顯著的抑制作用，對日本腦炎病毒也顯示出抑制作用，但幅度較小。蛹蟲草萃取物對登革或日本腦炎病毒的抑制作用並不在影響病毒進入細胞的能力。水溶性的蛹蟲草成分則沒有顯現對病毒的抑制效果。 研究動機 蛹蟲草是記載於中藥藥典的藥材(中國藥典，1990)，是由蛹蟲草菌(C. militaris)寄生在昆蟲的蛹發育而成，功能和冬蟲夏草類似，但是較易人工培養(莊曉莉等，2003)。作者之一的祖母每天服用蛹蟲草藥酒，已經一年多沒有感冒。由於好奇心驅使，我們開始收集資料。 我們查到蛹蟲草成分之一的蟲草素(cordycepin)(Cunningham el al.,1951)有抑制一些RNA病毒的作用，包括了致癌RNA 病毒、單純性疱疹病毒、Semliki forest 病毒、西方馬腦炎病毒、雞新城疫病毒及呼腸病毒(Smith et al., 1980)。而且蛹蟲草的已發表作用在抗腫瘤(劉潔等，1997)、調節免疫系統(陳桂寶等，1997)，改善腎功能(Wu et al., 2000)、肝功能(Nan et al., 2001)及性機能(劉潔等，1994)。再加上我們有位長輩為B型肝炎帶原者，在飲用蛹蟲草所泡的茶的兩年後，帶原指數降到正常值以下。這些因素使我們想研究蛹蟲草的抗病毒作用。 我們上網發現住處附近有研究室研究登革病毒和日本腦炎病毒，而西藥中也缺乏治療這兩種病毒的特效藥。我們查不到有關蛹蟲草對這兩種病毒影響的研究文獻，因此決定請求這個研究室的教授讓我們接受指導，研究蛹蟲草的萃取物是不是能夠抑制登革熱病毒或日本腦炎病毒。 研究目的 研究蛹蟲草的萃取物會不會抑制登革熱病毒或日本腦炎病毒。如果有抑制作用，再進一步研究是哪一類溶劑中的萃取物有抑制作用，及是不是可能有應用價值。並進一步設法了解抑制作用的機制是在抑制病毒進入細胞還是抑制病毒複製。 參、研究材料 研究材料主要是蠶蛹蟲草全草(圖一)，是將蛹蟲草菌(Cordyceps 圖一、蠶蛹蟲草全草 militaris LS901)接種在家蠶蛹內培育而成(莊曉莉等，2003)、中國蒼鼠的腎臟細胞(BHK-21)及登革DEN-2 ,PL046病毒(以下簡稱為DEN)、日本腦炎JEV, RP-9病毒(以下簡稱為JEV)。蠶蛹蟲草由黃檀溪博士提供。蛹蟲草萃取物的製備是將全草磨碎，分別放入水中隔水加熱至100oC 30分鐘或放入酒精溶液液浸泡三天後離心過濾濃縮。其它材料由指導老師研究室提供。BHK-21 細胞以含有2%FCS (Gibco)的RPMI 1640培養液培養。 肆、研究方法 一、 找出蛹蟲草萃取物之最低嚴重抑制細胞生長或活性的劑量： 首先研究蛹蟲草萃取物(分別溶在100%, 80%, 60%酒精、水，以下用溶劑的濃度作為試劑的代稱)對BHK-21細胞生長或代謝活性的影響。為求得蛹蟲草萃取物的最低嚴重抑制劑量。先將BHK-21種入96-well培養盤中(每個well置入104個細胞)，加入蛹蟲草萃取物（以濃度10 mg/ml作五次兩倍序列稀釋，得10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 mg/ml)。隔兩天後先經由顯微鏡觀察細胞的生長狀況，接下來進行XTT細胞活性測試。首先將XTT染劑(羅氏藥廠製造)加入每一個well中，每隔四十五分鐘觀察一次，待其有顯著的變色（染劑經過細胞的代謝後會變成橘色，且有深淺的差別），並且利用OD值（波長495nm）量化，可得出該環境中細胞的代謝活性，並找出最低嚴重抑制生長或代謝活性的濃度。 二、 以IFA(免疫螢光染色)測試蛹蟲草萃取物對病毒進入細胞的影響。先將細胞種入12-well 培養皿 (每個well置入105個細胞)，隔天進行病毒的感染（MOI=0.1）。並且在感染後加入不同濃度的蛹蟲草萃取物。 兩天後進行IFA染色，先將細胞固定，之後以脫脂奶粉去除非特異性結合，加入一級抗體(日本腦炎病毒或