广西三黄鸡抗马立克氏病相关分子遗传学标记的筛选的分析研究.pdfVIP

广西大学硕士论文 广西三黄鸡抗马立克氏病相关分了遗传学标记的筛选研究 广西三黄鸡抗马立克氏病相关分子遗传学标记的筛选研究 摘要 马立克氏病(MD)是鸡的一种恶性T淋巴细胞增生性疾病，对养禽业 危害极大。开展广西三黄鸡抗MD相关分子遗传学标记的筛选研究，旨在 确立相应的分子遗传学标记来促进三黄鸡的抗MD育种工作，以弥补目前 依赖疫苗免疫和生物安全为主的MD防制手段的不足。至此，已完成如下 主要工作： 利用聚合酶链式反应一限制性片段长度多态性(PCR．RFLP)分析的方 I、Cai I、Hinl 内切酶Alu I、Cfr I、研肛厂I和Rsa1分别进行分析。运用 在这6个位点所观测的纯合基因型组合对曰也口II等位基因纯合型鸡只进 B 行初步筛选，并通过进一步的克隆、测序，最终获得Bz II等位基因纯 Ks；易感个体2羽，代号分别为：A5、B21)。所获得7羽霞烟鸡的序列经 较，发现此基因区域碱基替代非常频繁，呈现出丰富的多态性。MD抗性个 抗性型)核苷酸和氨基酸同源性较高，分别达到98．9％和97．8％；这4羽霞 的核甘酸同源性达95．5％，与B挣单倍型(MD易感型)核苷酸同源性分别 分别为83．1％和85．4％，存在较大的差异。因此，推测MD抗性个体AIl、 性个体D8的丑也曰II基因序列虽与A1l等抗性个体的核苷酸同源性较低， 但在MDV攻毒实验中表现出明显的MD抗性，故推测D8的曰也曰II基因 序列为具有MD抗性的另一特征序列。而MD易感个体A5、B2l的曰正召II 基因序列则推测为两个MD易感的特征序列。 应用建立的逆转录酶一聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对霞烟鸡GH I双 基因转录子进行扩增，并对目的基因进行TA克隆，经HindIII、EcoR 广西大学硕士论文 广西三黄鸡抗马立克氏病相关分了遗传学标记的筛选研究 酶切和测序鉴定，将目的基因片段成功定向亚克隆于pSP72质粒T7启动子 下游的多克隆位点，经PCR和HindIII、EcoRI双酶切鉴定，采用HindIII R．NA 单酶切pSP72．GH重组质粒得到线性化转录模板DNA，在体外以T7 聚合酶转录合成，成功制备用于进行核糖核酸酶保护实验(RPA)的GH反 义RNA探针；采用核糖核酸酶保护技术对MD抗性与易感霞烟鸡个体进 达水平比易感个体低，且二者之间存在明显差异，从而可以初步的把GH 基因作为MD抗性选育的分子遗传学标记之一。 III、EcoR 载体的多克隆位点。重组质粒DNA经PCR和HindI双酶切鉴定 粒DNA进行荧光定量PCR，建立标准曲线。经分析显示标准曲线的Ct值 与标准品浓度的对数值之间存在良好的线性关系。动力学曲线分析表明， 在该反应体系和反应条件下，标准曲线的灵敏度都到达10拷贝／反应。结果 平的标准品质粒和标准曲线构建成功。 本研究的结果表明，MD抗性鸡与易感鸡间的层也曰II基因序列存在明 显的差异；MD抗性鸡与易感鸡在GH基因的表达水平上亦存在明显差异。 因此，可以初步的把曰也丑II基因和GH基因作为MD抗性选育的分子遗 传学标记。此外，本研究还成功构建了实时荧光定量PCR检测GH基因、 占．F基因和GAPDH基因表达水平的标准品质粒和标准曲线，为下一步定 量检测GH基因和岳，基因在不同MD抗性能力霞烟鸡外周血淋巴白细胞 的表达水平奠定了基础。 关键词 马立克氏病 霞烟鸡抗MD分子遗传学标记PCR．RFLP 基因表达核糖核酸酶保护实验荧光定量PCR标准曲线 广西大学硕士论文 广西三黄鸡抗马立克氏病相关分子遗传学标记的筛选研究 ARESEARCHONSCREENINGMAREK’SDISEASE RESISTANCE．RELATEDMoLECULARGENETIC MARKERSoF