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农杆菌介导DNA直接导入.PPT

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农杆菌介导DNA直接导入

* * * * * * * * 精子进入卵细胞后,尾部消失,头部变圆膨大,形成雄原核;卵细胞完成第二次有丝分裂后,其细胞形成雌原核。雄原核与雌原核接触,各自的核股消失、融合,二性染色体在其后的台子分裂中混合、配对,受孕宣告结束,一个新生命宣告开始。受精过程约需24小时。 * * * * * * * * * 操作简便,成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定,但转染效率低。 2. 脂质体介导法 脂质体包埋DNA,通过细胞膜进入细胞。 脂质体(lipofectin)载体法 应用玻璃显微注射器,直接把外源DNA注射到宿主细胞核里,使其整合到染色体上。 3. 显微注射法 1)外源基因制备:线性化的质粒或目的片段 2)收集受精卵:受孕后几小时内 3)显微注射:将外源基因注入受精卵的雄原核 4)受精卵移植 显微注射法(microinjection) 二乙氨乙基(DEAE)葡聚糖为多聚阳离子试剂,能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。 4. DEAE-葡萄糖转染法 葡聚糖 葡聚糖 DEAE-dextran 外源DNA 细胞 混合 DEAE-dextran对细胞有毒,常采用低浓度长时间处理 吸附到细胞表面后被细胞吞入,部分DNA可以进入到细胞核里。 4. DEAE-葡萄糖转染法 导入外源DNA的几种方法 三、转化率及影响因素 转化率(cfu / μgDNA):每微克重组DNA转化后,接纳DNA分子的受体细胞的个数,即阳性克隆数。 (一)转化率的计算: 转化率 = 产生菌落的总数 / DNA的加入量 三、转化率及影响因素 例:取1μl(0.1 ng/μl)完整的质粒转化100μl的感受态细胞。向转化反应液中加入900μl培养液,让细菌恢复一小段时间,取100μl铺板。培养过夜,产生1000个菌落,转化率为多少? 转化率=1000 / 0.01 ng DNA = 108 cfu /μg 三、转化率及影响因素 例:某一DNA重组实验的重组率为20%,转化率为107 cfu / mg 天然载体,经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低100倍,欲获得104个重组克隆,需要投入多少重组载体DNA进行重组实验? 104 = 107 cfu / mg ×10-2 × a × 20% 重组载体 a = 0.5 mg 三、转化率及影响因素 普通的亚克隆实验:1×10 6 cfu/μg DNA; 更复杂的亚克隆:1×107 cfu/μg DNA,如有限量的DNA的转化,T-A克隆; 构建文库: 1×108 cfu/μg DNA。 1)载体DNA类型、大小;重组DNA浓度、纯度 2)受体细胞 3)转化方法:同一转化方法技术参数影响转化率 (二)转化率的影响因素 三、转化率及影响因素 影响转化率的因素 (2)感受态细胞(competent cells) ①生长状态制备 感受态菌必须使用对数生长期的菌。 ②必须在冰冷的条件下制备。 ③CaCl2处理 要充分,使细菌细胞膜失去一些蛋白。 ④储存感受态菌要在-70℃以下 ⑤使用感受态菌时必须迅速融化 融化后一般不能再次冻存使用。 * * * * * * * * * * 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 * 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 * 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 * 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 * 先将实验植物材料,例如矮牵牛的叶片进行表面无菌消毒,用经过消毒的无菌不锈钢打孔器从叶片上取下圆形小片,即所谓叶盘,然后接种上含有重组Ti质粒的根瘤土壤杆菌。这种经接种处理的叶盘,在饲养平皿的滤纸上培养2天后,将滤纸连同叶盘转移到含有适量的卡那霉素的“长芽”培养基(shooting emdium)中,进行筛选与再生,接着再转移到“生根培养基”(rooting medium)上诱导幼芽生根,最后将小植株移栽在土壤中

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