红藻氨酸对癫痫大鼠海马线粒体机能障碍和超微结构损害的研究.docx

红藻氨酸诱导大鼠癫痫持续状态的海马线粒体机能障碍和超微结构损害摘要：目的：长期和持续的癫痫发作（癫痫持续状态）可导致神经损伤引起细胞改变。我们调查了这些细胞变化是否可以通过红藻氨酸（KA）诱导癫痫持续状态模型显示海马线粒体功能障碍和超微结构损害的可能。方法：水合氯醛麻醉SD大鼠，单方面微量注射KA（0.5 nmol）到海马CA3区诱导癫痫样海马脑电活动。海马齿状回（DG）、CA1、CA3区线粒体呼吸酶活性测定的关键在于应用KA30min或180min后。KA诱导癫痫持续状态的海马三个区域内的超微结构也可以用电镜检测。结果：在海马CA3区微量注射KA诱发海马癫痫样脑电活动。酶活性分析显示KA诱导癫痫持续发作180min后，海马DG、CA1或CA3区烟酰胺腺嘌呤二核苷酸细胞色素C还原酶(marker for Complexes I+III)显著活性下降。相反，细胞色素C还原酶琥珀酸(marker for Complexes II+III)和细胞色素C氧化酶(marker for Complex IV)的活动保持不变。可以辨别的线粒体超微结构损伤、肿胀，不同程度的膜完整性的破坏，也是在KA注射入海马180min后显现。结论：我们的研究表明，海马线粒体复合I呼吸酶功能障碍和超微结构损害与颞叶癫痫持续状态的长期发作有关。关键词：红藻氨酸；癫痫持续状态；海马；线粒体呼吸链复合I；线粒体超微结构线粒体是由双层单位膜围成的细胞器，它的主要功能是通过线粒体呼吸链氧化磷酸化生成细胞能量三磷酸腺苷。线粒体氧化磷酸化有线粒体内膜（1）中五个酶复合物组成。生化证据表明，脑ATP消耗多数是用来操作神经元的电活动（2）。因此，线粒体充足的能量供应对神经细胞的兴奋性和神经细胞的生存至关重要。癫痫发作可导致大量细胞的变化和级联，包括基因表达，受体组成，突触生理学和晚期细胞死亡的途径（3-9）。长期和持续的癫痫发作（癫痫持续状态）是医学紧急情况，可以导致永久性的神经和精神残疾（10,11）。随着神经细胞特征模式优先损失在海马中，癫痫持续状态导致人和动物模型出现显著的脑损伤，增加了后续发作的风险。相反，相对少数研究针对癫痫持续状态中的线粒体呼吸链功能或线粒体超微结构的改变。有限的报告表明，线粒体功能障碍的发生时由于撑起癫痫发作的后果，可能在癫痫发作致脑损伤中发挥重要作用。全身或脑内注射红藻氨酸（一种强大的兴奋性氨基酸激活的离子型谷氨酸受体亚型），可保持海马癫痫持续发作，遵照类似于人脑颞叶癫痫的选择性神经病理学模式。我们以前的报告（20）证实向麻醉大鼠海马CA3去微量注射KA可以诱发海马脑电图活动。在颞叶癫痫持续状态的实验模型基础上，本研究评估持续性癫痫样海马活动是不是导致海马线粒体呼吸链酶活性功能障碍和海马超微结构损害的关键。我们的电生理、生化、电子显微镜调查显示，线粒体的功能障碍和结构损害发生在KA诱导的颞叶癫痫发作的海马区。材料与方法所有试验程序符合实验动物委员会关于关心和使用实验动物的准则。尽可能减少使用动物的数量，并尽量减少实验动物的痛苦。动物准备实验动物为36只无病原体的成年雄性大鼠（280-350g）。其中28只用来研究线粒体呼吸酶的功能，余下8只进行线粒体超微结构的观察。实验大鼠来自国家科学委员会的动物实验中心（中国，台湾），在温度控制为24-25℃和12小时的光/暗周期的动物房间内喂养，可随意获取实验室大鼠饲料和自来水。最初，使用水合氯醛（400 mg/kg, i.p.）麻醉大鼠，用气管插管保持呼吸道通畅，右侧股动脉和股静脉插管测量全身动脉压，并管理麻醉剂。实验准备完成后，大鼠头部固定在大脑定位仪上（model 1430;Kopf,Tujunga, CA, U.S.A.），其余肢体放置在加热垫上，使其体温保持在37℃。整个实验过程，通过静脉注射水合氯醛（40 mg/kg/h）维持麻醉（21）。颞叶癫痫持续状态实验正如我们先前的研究一样，KA（Tocris, Ellisville,MO, U.S.A.）溶入0.1M的磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)，使之浓度为0.5mmol，通过立体定位仪在3.0-3.5毫米后方囟，1.4-2.2毫米的中线和3.5-4.0毫米以下的皮质表面注入左大脑海马CA3区。注射量限制在50nl ，采用0.5ul 的Hamilton微量注射调节器和27号针头注入。微量注射调节器的注射量通过对每一组动物注射相同的PBS缓冲液来控制。脑电图信号通过有大脑CA3去不锈钢双极同心电极（SNE-100; Rhodes Medical Instruments,Woodland Hills, CA, U.S.A.; tip diameter: 100μm)）获取，使用相同的定位坐标，用于微量注射。通过一个通用放大器(20-4615-58;