bcrabl逆转录病毒介导小鼠慢性粒细胞白血病样模型建立.docVIP

bcrabl逆转录病毒介导小鼠慢性粒细胞白血病样模型建立 　【摘要】 目的: 构建bcrabl逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病（CML）样模型,为深入 研究 CML发病机制和 治疗 奠定基础. 方法 : bcrabl逆转录病毒Mig210载体经PhoenixAmpo细胞包装后,取上清液感染5FU 处理后的BALB/c雄性小鼠骨髓细胞,再经尾静脉移植入经致死剂量γ射线（900cGy）照射的同种雌性受体鼠中.用形态学、RTPCR和Western Blot鉴定小鼠成模情况. 结果: 小鼠移植8~9 wk后，外周血白细胞达2×1010~3×1010/L（为对照鼠的5~8倍）,外周血涂片幼稚细胞达到0.10~0.20;骨髓粒系细胞显著增高,易见幼稚细胞,肝脾也可见白血病细胞浸润;移植4~5 wk后在受体鼠骨髓和脾脏检出bcrabl融合基因,8~9 wk后在肝脏亦检测出bcrabl融合基因,同时在骨髓和脾脏也检测到bcrabl融合蛋白.建模成功的小鼠3~5 mo后相继死亡.结论： 成功建立bcrabl逆转录病毒介导的小鼠CML模型,可用于后续CML信号通路和治疗机制的研究. 【关键词】 慢性粒细胞白血病 BCR 融合蛋白 逆转录病毒载体 动物模型 　0引言 　　慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是一种起源于骨髓内异常多能干细胞的骨髓增殖性疾病,其发病机制复杂,但持续表达的bcr/abl融合基因在该病的形成过程中起重要作用. 目前 在含有bcr/abl融合基因的细胞模型上进行研究的报道较多. 对CML体内研究的模型主要是基于bcrabl转化的造血细胞株在小鼠体内的定殖,以及用K562细胞移植裸鼠成瘤后,再接种到免疫缺陷型小鼠致白血病的方法［1］.而利用逆转录病毒转染的小鼠骨髓移植模型研究人类白血病细胞的发生、 发展 及其生物学特性,并用来进行实验治疗,是20世纪90年代以来国外白血病实验研究的新发展［2］,国内尚未见报道.本课题拟探索建立bcrabl逆转录病毒Mig210骨髓转染/移植诱导的小鼠白血病样模型,为后续CML信号通路和治疗机制的研究奠定基础. 　　1材料和方法 毕业论文 　　1.1材料BALB/c小鼠，6~12 wk龄，体质量21~23 g, 雌雄各半, 均为清洁级动物,由本校动物中心提供.逆转录病毒载体MIGRP210由美国Warren S Pear教授惠赠.小鼠急性粒单核白血病细胞株WEHI3购于 中国 医学 科学 院基础医学细胞中心.RTPCR试剂盒购于TakaRa公司;转染试剂jetPEiTM 为Polyplus公司产品;聚凝胺(Polybrene)为Sigma公司产品;抗cabl多克隆抗体、二抗为抗兔IgHRP,羊抗鼠αtubulin mAb，ECL显色试剂盒均购于Cell Signaling公司;rmIL3，rmIL6，rmSCF均购于PeproTech公司. 　　1.2方法 毕业论文 　　1.2.1逆转录病毒上清的制备将Mig210和MigRI空载在jetPEITM的介导下转染PhoenixAmpo细胞,36 h后收集第一批病毒上清,72 h后收集第二批病毒上清,用有限稀释法感染NIH3T3细胞计数绿色荧光测病毒滴度,达到1×1011~1×1012IU/L离心过滤,存于-80℃备用. 　　1.2.2供体鼠骨髓细胞的制备尾静脉注射雄性供体BALB/c小鼠5氟尿嘧啶（5FU）,4 d后处死小鼠取骨髓，用DMEM预激培养基（含胎牛血清、WEHI3B细胞上清、青霉素、链霉素、肝素、环丙沙星、L谷氨酰胺、rmIL3，rmIL6和rmSCF）培养24 h后,计数有核活细胞. 毕业论文 　　1.2.3病毒感染骨髓原代细胞使用含500 mL/L逆转录病毒上清，10 mmol/L Hepes, 2 mg/L聚凝胺,pH 7.4 DMEM培养基,病毒和细胞在20℃,1000 g离心90 min共沉降,2~4 h的吸附后更换培养基,48 h后进行第二轮重复上述的转导和共沉降,吸附2 h后收集细胞,用DHanks洗涤，计数有核活细胞. 　　1.2.4感染逆转录病毒的骨髓原代细胞的回输雌性受体小鼠照射前5 d接受抗生素直到移植后2 wk,经450 cGy的γ射线照射二次,中间休息3~6 h,照射后分4组,A组15只:输含有Mig210转染的骨髓细胞;B组10只:输含有MigR1空载的骨髓细胞；C组10只:回输经5FU处理4 d后的供体小鼠骨髓细胞；D组10只: DHanks空白对照.E组10只:未经处理的正常对照组.移植后将受体鼠于IVC层流房隔离笼饲养(符合SPF).