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CK20单克隆抗体制备及鉴定 　【关键词】 克隆 　　【关键词】 抗CK20单克隆抗体；SPASepharose；杂交瘤技术；Western Blot；ELISA 　　0引言 　　研究CK20表达用于诊断和评估膀胱肿瘤，已成为国内外研究热点之一. 但目前国内的抗CK20 mAb一直依赖进口，价格昂贵且不便运输，严重影响其推广应用和研究. 我们于2002年成功地从膀胱癌T24细胞系中提取CK20抗原［1］，我们采用CK20抗原通过杂交瘤技术制备抗CK20 mAb，为进一步研制CK20 mAb胶体金试剂盒筛查膀胱癌奠定基础. 　　1材料和方法 　　1．1材料 　　①动物及试剂 BALB/c小鼠购自第三军医大学动物中心，鼠龄6~12 wk，体质量18~22 g，雌雄不限；CK20抗原为本实验室纯化所得；Freund氏完全佐剂和不完全佐剂及HAT培养基为Gibco产品；SP2/0骨髓瘤细胞来自中国预防医学科学院病毒研究所；细胞融合剂PEG4000为Mereck产品，SPASepharose CL4B为Pharmacia产品；IgA, IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b及IgG3蛋白均为Sigma产品. ②仪器 国产96孔和24孔培养板、超净工作台；德国Heraeus离心机，BioRad公司550酶标仪、电泳仪、转膜系统及凝胶成像分析系统；德国LKB层析系统；Olympus倒置显微镜. 　　1.2方法 　　1.2．1动物免疫及脾细胞收集免疫方法参照文献［2］，共免疫3只小鼠，免疫后用琼脂扩散法检测小鼠血清产生抗体情况，选高效价者剪颈放血取脾，收集脾细胞，并作100 g/L台盼蓝染色，同时收集血液，分离血清供测定抗体滴度用. 　　1.2．2细胞融合及杂交瘤细胞选择性培养参照文献［2］进行，以HAT为培养液，滴加到已铺有饲养细胞96孔培养板中，置50 mL/L CO2培养箱中培养. 　　1.2．3阳性克隆筛选及克隆化培养以CK20抗原包被酶标板微孔，采用间接ELLSA法检测所有生长孔的培养上清液，并分别以小鼠多抗血清和PBS做阳性和阴性对照，经酶标仪测定A490 nm值，以等于或大于对照2.1倍为阳性. 阳性孔采用有限稀释法进行细胞克隆化. 克隆化培养1 wk后采用ELISA法检测有细胞克隆化生长的所有孔上清液，阳性者及时部分冻存，部分扩大培养. 待克隆长至孔底面积的1/3~2/1时，转至24孔扩大培养. 　　1.2．4杂交瘤细胞核型分析方法同外周血淋巴细胞染色体制作［3］，最后于油镜下计数20个分散较好且完整的中期分裂相. 　　1.2．5腹水抗体的制备及抗体含量测定共选择10只体健BALB/C小鼠，每只腹腔接种医用石蜡油0.5 mL，12 d后每只腹腔接种6×106个已克隆化细胞（约0.5 mL）. 2 wk后有明显腹水产生时剪颈处死，分别收集血液和腹水，1000 r×10 min，取上清，-20℃保存. 并采用Bradford assay法测定抗体含量. 　　1.2．6mAb纯化采用本实验室建立的方法纯化CK20 mAb［4］. 　　1.2．7mAb特性分析①mAb特异性鉴定 用Western Blot法，以纯化所得CK20 mAb作一抗与体外培养的膀胱肿瘤T24细胞行免疫印记试验，并以CK20抗原做对照. 将培养细胞裂解,离心,取上清用于SDSPAGE电泳,转膜后加CK20 mAb反应,显色,凝胶成像分析系统分析. ② mAb Ig类型及亚型鉴定 采用双向琼脂免疫扩散法［5］，将杂交瘤细胞培养上清液离心并浓缩10~20倍，加样于20 g/L琼脂中，分别加标准IgG, IgG1, IgG2a,IgG2b,IgA和IgM进行双向免疫扩散，将加样后琼脂板放入湿盒，置37℃水浴箱中24 h后观察结果. ③抗体效价检测 采用间接ELISA法，同时测定细胞培养上清液,免疫小鼠血清多抗,腹水mAb和纯化mAb效价. 　　　2结果 　　通过测定被免疫小鼠的尾血发现，3只小鼠血清与CK20抗原均在琼脂管中相互扩散而形成一条抗原抗体结合线. 最后一次免疫72 h后，剪颈放血取脾，收集脾细胞，共获5×106脾细胞，台盼蓝染色后不着色细胞约占97%. 细胞融合后接种于2块96孔培养板中，共接种192孔，第15日时可见40孔有细胞生长，占20%. ELISA测定结果发现有8个阳性孔，占生长孔的20%. 取阳性克隆孔细胞株采用有限稀释法进行4次克隆化，每次接种60孔，其中有一株细胞（CK206）随着克隆次数增多，抗体阳性细胞生长孔从66%增至100%(表1)，选定细胞形态较好的细胞生长孔进行扩大培养和冻存，并命名为表1杂交瘤细胞株克隆化结果(略) 　　小鼠脾脏淋巴细胞染色体众数为40，SP2/0为62~68，故杂交瘤细胞标记染色体