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DNA甲基转移酶3A siRNA 真核表达载体构建及鉴定 　【摘要】 目的:构建DNA甲基转移酶3A（DNA methyltransferases 3A,DNMT3A)siRNA重组质粒稳定表达载体，为进一步探讨DNMT3A在多种生物学过程及肿瘤发生发展中的机制提供工具。方法：依据DNMT3A基因的cDNA序列，利用siDESIGN软件获得RNAi靶位点后设计出对应的siRNA寡核苷酸模板，体外合成寡核苷酸片段经退火形成短双链，克隆到真核表达载体pSUPEREGFP1中，构建DNMT3A siRNA重组质粒载体，经酶切鉴定后转染人肝癌细胞系SMMC7721，荧光实时定量PCR初步分析DNMT3A经RNA干涉后的沉默效应。结果：成功构建了靶向DNMT3A基因的siRNA重组稳定表达载体，此载体有效地降低了肝癌细胞系中DNMT3A基因的表达水平。结论：通过该方法初步确定了沉默DNMT3A基因的较佳靶点。 【关键词】 DNA甲基转移酶3A siRNA 载体 DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，参与机体的许多生物学过程，如基因转录抑制、基因组印迹、X染色体失活、染色质完整性的维持、细胞分化和发育的调控等[12]。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)催化并维持的。人类的DNMT包括DNMT1、DNMT2、DNMT33个家族，其中DNMT3又分为DNMT3A和DNMT3B，它们同是DNA重新甲基化酶[3]。 许多研究发现，肿瘤细胞的DNA甲基化模式常发生异常改变，主要表现为基因组的整体低甲基化和局部位点的高甲基化[46]。同时发现 DNMT各成员在多种肿瘤中异常表达，其发生往往先于甲基化模式异常，是肿瘤细胞的一个特征性早期分子改变[710]。 随着人类表观基因组计划的提出和实施，在各种生物学过程包括肿瘤的发生发展中，DNMT家族不同成员对于甲基化模式建立的确切作用逐渐受到关注[1116]，尤其是DNMT3A基因敲除的小鼠对其功能并没有解析[17]。我们利用RNAi技术，构建靶向DNMT3A siRNA真核表达载体，检测是否可降低肝癌细胞系中DNMT3A的表达，以期为进一步研究DNMT3A在多种生物学过程中的功能提供良好的工具。 1 材料及方法 1．1 材料 真核siRNA表达载体pSUPEREGFP1质粒由吴殿青教授（美国耶鲁大学医学院）惠赠，E.coli DH5α购自上海生工生物工程技术服务有限公司，人肝癌细胞系SMMC7721购自上海典型培养物保藏中心，限制性内切酶Bgl Ⅱ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、T4 多聚核苷酸激酶、DNA 连接酶、SYBR premix Ex TaqRM Kit、Trizol RNA分离试剂购自TaKaRa公司，质粒抽提试剂盒、转染试剂LipofectamineTM 2000、RPMI 1640培养基来自Invitrogen公司，凝胶回收试剂盒为Axygen公司产品，逆转录试剂盒为Promega公司产品，胎牛血清、小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司。引物序列由上海申能博彩生物科技有限公司合成。 1．2 方法 1．2．1 DNMT3A靶向siRNA设计与合成 针对人DNMT3A的cDNA 序列(GenBank No.NM_175629.1,NM_153759.2，NM_022552.3),利用Dharmacon公司的在线设计软件siDESIGN(/DesignCenter)寻找候选DNMT3A RNAi靶点序列。通过BLAST(/BLAST/)同源性比对分析其是否具有基因特异性。根据pSUPEREGFP1载体要求设计合成siRNA寡核苷酸模板。寡核苷酸序列由上海申能博彩生物科技有限公司合成。 1．2．2 构建DNMT3A siRNA的稳定表达载体 将合成的寡核苷酸分别溶解在3.36 μl H2O 中（终浓度为1 mmol·L-1），取 1 μl寡核苷酸,加入48 μl 的退火缓冲液（100 mmol·L-1醋酸钾、2 mmol·L-1醋酸镁、30 mmol·L-1 HEPESKOH,pH 7.4）中,95℃ 5 min后缓慢冷却退火至室温，形成短双链。再与经Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切的 pSUPEREGFP1载体连接后转化DH5α感受态细胞,挑取卡那霉素（100 μg·ml-1）阳性的克隆，培养后少量抽提重组质粒，经Bgl Ⅱ单酶切和EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切鉴定，分别命名为pSUPEREGFP1S3A1、pSUPEREGFP1S3A2、pSUPEREGFP1S3A3。 1．2．3 细胞培养和重组质粒转染 肝癌细胞系SMMC7721培养于含10％小牛血清的RPMI 1640培养基中。