MMP9、CD44v6在皮肤鳞状细胞癌及基底细胞癌中表达对比探究.docVIP

MMP9、CD44v6在皮肤鳞状细胞癌及基底细胞癌中表达对比探究 　 作者：王琦 刁路明 孙凯 付文荣 田英 【摘要】 目的：探讨基质金属蛋白酶MMP9、细胞粘附因子CD44v6在皮肤鳞状细胞癌（Squamous cell carcinoma,SCC）和基底细胞癌（Basal cell carcinoma,BCC）中表达的意义及相关性。方法：采用免疫组织化学法对82例石蜡包埋组织标本进行检测和统计分析。结果：①MMP9在皮肤SCC中阳性率（88.1%）显著高于皮肤BCC组（48%）和正常皮肤组（13.3%），CD44v6在正常皮肤中的阳性率（100%）显著高于皮肤SCC组（66.7%）和皮肤BCC组（20%）；②MMP9的高表达率与皮肤SCＣ的分化程度呈负相关，CD44v6的高表达率与皮肤SCC的分化程度呈正相关；③MMP9和CD44v6在皮肤SCC和BCC中表达无明显相关。结论：CD44v6和MMP9与皮肤BCC和SCC的发生、分化密切相关，可作为研究和判断皮肤SCC和BCC生物学行为和预后独立的重要指标。 【关键词】 鳞状细胞癌； 基底细胞癌； MMP9； CD44v6； 免疫组织化学 MMP9是蛋白水解酶中较为重要的一类，参与细胞外基质和细胞膜的降解，促进肿瘤侵袭和转移［1］。CD44是一类分布广泛的跨膜糖蛋白，参与机体各种生理功能，其外显子按表达和拼接方式的不同分为CD44s和CD44v［2］，其中CD44v6与肿瘤侵袭和转移关系最为密切。皮肤SCC和BCC均是皮肤角朊细胞来源的肿瘤，其中SCC是皮肤恶性肿瘤中最常见的一种，占40%以上。CD44v6或MMP9在皮肤肿瘤中报道极少，而CD44v6和MMP9在皮肤BCC和SCC中对比研究，国内外尚未见报道。本研究运用免疫组化法检测MMP9和CD44v6的表达情况，研究其与皮肤肿瘤的病理类型、分化程度的关系及两种蛋白表达的相关性，现报道如下。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 标本采取和临床资料 82例病理研究标本取自同济医学大学附属襄樊市中心医院病理科2000～2007年病理存档的石蜡标本，均经组织病理学明确诊断。男45例，女37例，年龄32～65岁，平均46岁。其中皮肤鳞状细胞癌患者42例（高分化鳞癌15例，中分化鳞癌13例，低分化鳞癌14例），皮肤基底细胞癌25例，正常皮肤15例（取自我科整形手术中切取的正常皮肤）。 1.1.2 主要试剂 即用型鼠抗人MMP-9单克隆抗体、即用型鼠抗人CD44v6免疫组化单克隆抗体、SP免疫组化染色试剂盒均购于福州迈新生物技术开发公司；二氨基联苯胺（DAB）显色剂购于北京中山生物技术公司。 1.1.3 主要仪器 -80℃超低温冰箱；CX51日本Olympus光学照相显微镜；德国Leica组织切片机；YWY781B医用微波炉。 1.2 方法 1.2.1 固定和石蜡包埋 所有标本经10%中性甲醛常规固定，石蜡包埋。制成4μm厚连续切片，分别做HE染色和免疫组化染色。 1.2.2 免疫组化染色方法 (1)石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH7.4）冲洗3次，每次3分钟；(2)取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液置于微波盒中，用大火煮开，再将组织片浸没在修复液中，加盖，中火煮15分钟，取出微波盒，冷却至室温后，取出组织片；(3)每张切片加50μl过氧化酶阻断溶液 (试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min；(4)PBS(pH7.4)冲洗3×3′。(5)沥干PBS液，每张切片加50μl的非免疫性动物血清(试剂B)，室温孵育10min；(6)甩去血清，分别加MMP9(浓度1:100)和CD44v6 (浓度1:300)工作液50μl，4℃冰箱中过夜；(7)第二天将过夜切片用PBS冲洗3×5′；(8)沥干PBS液，每张切片加50μl生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温孵育20min；(9)PBS冲洗3次，每次3min；(10) 沥干 PBS液，每张切片加50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育20min。PBS冲洗3次，每次3min；(11)沥干PBS液，每张切片加100μl的新鲜配置的酶底物显色液（DAB）进行显色5min；(12)自来水冲洗，苏木素复染，用中性树胶进行封片； (13)用PBS代替一抗作空白对照。 1.3 免疫组化结果判定 CD44v6蛋白阳性表达为细胞膜上有棕黄色颗粒样物质沉着。MMP9蛋白阳性表达为细胞浆内有棕黄色颗粒样物质沉着。结果判定采用半定量积分法，免疫组化染色记分标准如表1，以染色强度与阳性细胞的百分比的乘积做为半定量标准。MMP9以0～3分为阴性（-），4～6分为弱阳性（+），7～9分为阳性（++），10～12分为强阳性（+++）［3］；CD44v6以