β葡聚糖对巨噬细胞增殖 胞内游离钙及cAMP浓度影响.docVIP

β葡聚糖对巨噬细胞增殖 胞内游离钙及cAMP浓度影响 　【摘要】 探讨β葡聚糖对RAW264.7细胞增生、胞内游离钙及cAMP浓度的影响。方法： 中性红比色法检测细胞生长, 酚试剂法检测细胞蛋白质合成, 动态检测β葡聚糖对胞内游离钙和cAMP浓度的影响。结果： 微量β葡聚糖可促进细胞生长及蛋白质合成;β葡聚糖作用后3～5 min使胞内游离钙浓度升高,作用1 min 后使cAMP浓度升高, 并保持较高水平。结论： 胞内游离钙及cAMP是β葡聚糖对RAW264.7细胞作用过程中重要的信使分子。 【关键词】 β葡聚糖 胞内游离钙 环磷酸腺苷 RAW264.7细胞系 增殖 ［Abstract］ Objective: To explore the effect of βglucan on proliferation, intracellular calcium and cAMP levels of RAW264.7 macrophage cell line.Methods： Cell growth and proliferation were detected by neutral red colorimetric assay, protein synthesis by Lowry′s test, and the concentration of cytosolic calcium and cAMP were determined continuously. Results： Cell growth and protein synthesis were enhanced by βglucan; the concentration of cytosolic calcium was elevated 3～5 min after treatment with βglucan cAMP level increased 1 min after the treatment and maintained at high level. Conclusion： Cytosolic calcium and cAMP were important signal molecules in evaluating effect of βglucan on RAW264.7 cell line. ［Key words］ βglucan; intracellular calcium; cAMP; RAW264.7 cell line; proliferation 随着免疫抑制剂、激素、广谱抗生素的大量应用,器官移植技术的广泛开展、各种导管的广泛应用及肿瘤治疗的广泛应用,真菌感染尤其深部真菌性医院感染日益增多。 β葡聚糖是真菌细胞壁含量最高的多糖。本研究以小鼠巨噬细胞RAW264.7为观察对象，观察不同浓度及不同时间的β葡聚糖对RAW264.7细胞的直接影响, 特别是对细胞内第二信使传递的影响, 以探讨β葡聚糖对RAW264.7细胞的作用机制。 1 材料与方法 1.1 试 剂 RPMI1640、胎牛血清购自Gibco公司；Fura2 AM 购自中国科学院药物所；β葡聚糖和EGTA购自Sigma公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯。 1.2 细胞培养 小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海生命科学研究院。于37℃，5%CO2湿润环境中培养, 每3天更换1次培养液, 细胞生长汇合成单层细胞时及时传代, 常规培养液为含10%胎牛血清的RPMI1640。 1.3 细胞生长曲线和蛋白质含量的测定 取对数生长期的细胞按3×103 个/孔接种于96孔板(Cellstar),共接种16板。待细胞贴壁后，吸出孔内的培养液和未贴壁的细胞。各给药组分别给予含12.5，25，50，100，200和400 μg/ml β葡聚糖的培养液200 μl，进行培养。每板上作对照,每个β葡聚糖浓度作3个平行孔。每天定时取上述培养板2块, 于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况, 然后将其中1块板以中性红比色法［1］检测细胞生长情况,另1板用lowry法测定蛋白质含量［2］。以培养时间(d)为横坐标, 中性红比色法测得的D值和蛋白质含量为纵坐标, 分别绘制细胞生长曲线和蛋白质变化曲线。 1.4 胞内游离钙浓度测定　 细胞内游离钙浓度的测定按文献［3］方法进行。 1.5 cAMP浓度测定　 于100 ml培养瓶内接种RAW264.7细胞, 待细胞生长接近汇合时给予不同浓度β葡聚糖刺激, 分别于刺激后1，5和15 min 3个时间点取样。取样