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中药清除羟自由基实验改良 　 作者：余庆皋，刘捷频，吴梅青 【摘要】 　　目的对邻二氮菲-Fe2+氧化法进行改良，使其在用于自由基清除剂筛选时更为有效和更为敏感。方法在不同的pH环境、不同的保温时间及不同的测定波长条件下进行对比实验。结果邻二氮菲-Fe2+络合物在pH 4.5的环境下及510 nm的测定波长时有较大的吸光度，30 min的保温时间使各管有较大并较为稳定的吸光度。结论通过对邻二氮菲- Fe2+氧化法的实验改良能提高该方法筛选自由基清除剂的灵敏度。 【关键词】 自由基清除剂； 邻二氮菲； 羟自由基 　　Abstract：ObjectiveThe improvement can be carried out to the oxidation of phenathroline-Fe2+ in order to be effective and more sensitive in screening the free radical scavenger.MethodsMaking experiments by comparing the conditions of different pH, heat preservations and various wavelengh.ResultsThe complex of phenathroline-Fe2+ had great absorbance with 510 nm wavelength in the environment of pH4.5, and the absorbance was larger and more stable after the 30 min heat preservation.ConclusionThe improvement can increase the sensibility for sereening the free radical scavenger. 　　Key words：Free radical scavenger; Phenathroline; Hydroxy radical 机体在代谢过程中产生多种自由基，包括超氧阴离子自由基（O-2·）、羟自由基（·OH）及其活性衍生物H2O2等，其中以·OH化学性质最活泼。一定数量的氧自由基可为机体所用，但过多的氧自由基将作用于体内蛋白质、核酸、脂类等生物分子，造成细胞结构和功能受损，进而导致体内代谢紊乱引起疾病［1～4］。因此，自由基清除剂的合成及寻找成为当前医药研究的主要方向之一，而中药的天然、丰富及低毒更受人们的青睐。目前人们测定自由基清除剂清除羟自由基的方法有很多，其中邻二氮菲- Fe2+氧化法操作简单，设备要求不高，易于推广和应用。本实验对该方法进行了若干改良。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂维生素C（郑州羚锐制药有限公司生产）、邻二氮菲（天津市科密欧化学试剂有限公司生产，分析纯）、硫酸亚铁铵（广东光华化学厂有限公司生产，分析纯）、过氧化氢（广东汕头市西陇化工厂生产，分析纯）、磷酸二氢钾（上海市国药集团化学试剂有限公司）、无水乙醇和氢氧化钠（湖南汇虹试剂有限公司生产，分析纯）。 　　1.2 仪器752N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司生产），DK-600S三用恒温水浴箱（上海精密实验设备有限公司生产）。 　　1.3 方法以维生素C作为自由基清除剂，用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生的·OH。H2O2/Fe2+体系产生的·OH将邻二氮菲-Fe2+氧化为邻二氮菲-Fe3+，使邻二氮菲-Fe2+对536 nm波长的最大吸收减弱，A536明显降低。当反应体系中存在·OH清除剂时，此氧化过程受抑制，A536则降低不明显，并可通过A536值比较·OH清除剂的清除能力［5］。对该实验进行三个方面的改良：一是将反应环境由pH 7.4改为pH 4.5的酸性环境；二是将37℃保温时间由60 min改为30 min；三是测定吸光度的波长由536 nm改为510 nm。实验过程中分别在pH 7.4的磷酸缓冲液及pH 4.5乙酸-乙酸钠缓冲液的环境下进行对照实验；在保温5～60 min的时间范围内、536 nm和510 nm波长分别测定吸光度，比较两种pH条件下吸光度的差异。反应中依次加入邻二氮菲、缓冲液、自由基清除剂维生素C、Fe2+及H2O2为加药管；不加维生素C为氧化管；不加维生素C及H2O2为对照管。 　　1.4 统计学处理组间采用t检验，数据以±s表示。 　　　2 结果 　　2.1 不同测定波长及不同pH环境下的比较从表1可以看出，邻二氮菲-Fe2+络合物的最大吸收波长为510 nm，而最佳酸碱环境为pH 4.5。表1 不同