中药骨康对体外培养界膜分泌TNF-α表达抑制实验探究.docVIP

中药骨康对体外培养界膜分泌TNF-α表达抑制实验探究 　 作者：胡年宏 ，丁文玲 ，刘庆思 摘 要: 目的: 观察中药骨康体外培养假体周围界膜TNF-α的影响。 方法: 将备用的人工假体周围界膜放入RPMI培养液中（含15%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素），用眼科剪剪成1mm 3 大小组织悬浮液。取24孔培养板1块，分对照组、10%骨康组、20%骨康组3组，培养72h，取上清液，酶联法测定TNF-α。 结果: 骨康10%浓度组与对照组相比无显著性差异（Pgt;0.05），而骨康20%浓度组与对照组相比有显著性差异（Plt;0.05）。 结论: 骨康高浓度时能抑制假体周围界膜TNF-α的分泌。 关键词: 中药骨康;假体界膜;TNF-α;体外培养 人工关节置换术后最重要的并发症是假体周围骨溶解导致的假体无菌松动，松动的机理还不完全清楚。随着骨代谢研究的进展，调节破骨细胞形成和功能的肿瘤坏死因子（TNF-α）在人工关节置换术后无菌松动中的作用成为人工关节研究的新热点。本研究拟建立界膜组织培养法，并初步探讨中药骨康含药血清对体外培养界膜TNF-α分泌的影响。 1 材料与方法 　　1.1 材料 Hank’s液;RPMI-1640培养液;10%胎牛血清（购于永兴公司，杭州四季青制造）;TNF-α试剂盒（由武汉博士德公司提供）;中药骨康煎剂，广州中医药大学附属骨伤科医院提供（由黄芪、肉苁蓉、丹参、女贞子、淫羊藿、川芎组成）;界膜组织15g（取自73岁男性患者，行骨水泥型人工关节术后7年松动下沉来行返修术者）。 　　1.2 主要仪器 培养箱（美国SL）;超净工作台（上海净化设备厂）;酶标仪（Barad3300）。 　　 1.3 方法 ①骨康含药血清的制备:骨康为中药煎剂，由广州中医药大学附属骨伤科医院生产，骨康方总生药量110g，取2剂剂量即220g加入1000mL水中煎煮浓缩到150mL，即含生药量1.43g/mL，按 4.8g/kg剂量灌胃，相当临床剂量的10倍。大鼠 用上述药物分别灌胃，每次17.5mL/kg，每天2次，间隔5h，连续灌胃3d，最后一次灌胃2h后腹主动脉取血，离心获取血清，灭活，抽滤除菌，置-20℃保存备用。 ②体外界膜组织培养:参照有关文献 〔1，2〕 ，将备用的人工假体周围界膜（15g）从低温冰箱中取出，待自然融解后，将界膜放入Hank’s液中清洗后置于RPMI-1640培养液中（含15%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素），然后将界膜标本用眼科剪剪成1mm 3 大小组织悬浮液。取24孔培养板1块，分空白对照组、骨康组，后者又分10%含药血清浓度组及20%含药血清浓度组两个亚组，共计3个组，每组8个培养孔。对照组中加1mL组织悬浮液，10%含药血清浓度组中加0.9mL组织悬浮液，20%含药血清浓度组中加0.8mL组织悬浮液。 ③骨康含药血清的添加:10%含药血清浓度组加入0.1mL骨康含药血清。20%含药血清浓度组加入0.2mL骨康含药血清。添加药物后在5%CO 2 、37℃饱和湿度下培养72h，取上清液。 ④TNF-α含量测定:培养72h后，取上清液，用酶联法测定TNF-α。 ⑤上述界膜组织标本同时做细菌培养。 　　 1.4 统计分析 测定的所有数据应用SPSS11.5统计软件，采用方差分析统计分析。 　　2 结果 界膜组织和不同浓度含药血清的骨康共同培养72h，应用酶联法测TNF-α，结果是骨康低浓度组与对照组相比无显著性差异（Pgt;0.05），而骨康高浓度组与对照组相比有显著性差异（Plt;0.05）。见表1。 表1 培养72h界膜组织 　　　 3 讨论 3.1 界膜的组成及在骨溶解中的作用 1975年，Charnley 〔3〕 首先发现假体周围存在一层界膜组织，证实骨水泥周围的界膜组织中存在大量巨噬细胞和异物巨细胞。随后的研究表明，无论是否应用骨水泥，在骨―骨水泥界面或骨―金属界面之间均存在着这种含大量组织细胞的结缔组织界膜。现代研究 〔4〕 认为界膜主要由纤维基质、单核和多核组织细胞以及慢性炎细胞构成，可形成一些皱褶或乳头状突起，与骨性关节炎滑膜有相似之处。应用组织学技术和细胞表面标志蛋白的免疫化学分析技术研究显示，界膜组织中含有MΦ、异物巨细胞、成纤维细胞、破骨细胞及淋巴细胞。界膜组织细胞分泌不同细胞因子产物能影响骨转换，这些细胞因子包括IL-1、IL-6、TNF-α。尽管假体周围界膜中细胞构成不同，但从失败的骨水泥型和非骨水泥型假体周围界膜中均含有这些细胞因子，这些细胞因子能调节炎性反应，这些炎性反应介质在假体周围骨溶解及假体松动过程中起重要作用 〔5〕 。其中TNF-α最为重要。 3.2 TNF-α引起假体周围骨溶解的