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胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究 摘 要 通过沉淀离心法提取胰蛋白酶的专一性抑制剂-鸡卵类粘蛋白（CHOM）,作为亲和配基，利用亲和层析法进行分离纯化胰蛋白酶，接着以抑制剂对酶反应速度的影响了解酶促反应，掌握其规律，来最大限度地实现酶促反应的高效率，寻找最有利的反应条件以及了解酶在代谢中的作用，最后SDS进行酶纯度检验以及其相对分子量的测定。 关键词：胰蛋白酶 鸡卵粘蛋白 亲和层析法 米氏常数 酶促反应动力 聚丙烯酰胺凝胶电泳 Trypsin of isolation and purification and dynamic research ABSTRACT Through the precipitation centrifugation extraction specificity of trypsin inhibitor - chicken egg kind mucin (CHOM), as affinity ligands, using the method of affinity chromatography separation and purification, and then to by trypsin inhibitor enzyme reaction speed is known about the effects of enzymatic reaction, grasp their rule, come maximally realize enzymatic reaction efficient, find the most favorable reaction conditions and understand the role in metabolic enzymes, finally sdsfor enzyme and its relative molecular weight inspection purity of determination. 目 录 摘 要 Ⅰ ABSTRACT Ⅱ 目 录 Ⅲ 1 引言 1 2 材料与方法 1 2.1原料与试剂 1 2.2仪器设备 1 2.3实验方法 2 2.3.1CHOM的分离 2 2.3.2CHOM的定量 2 2.3.3胰蛋白酶的分离 2 2.3.4酶活力的测定 2 2.3.5纯化效果及纯化蛋白质相对分子量的测定 2 3 结果与讨论 3 3.1CHOM的分离和定量 3 3.2胰蛋白酶的纯化 4 3.3酶活力的测定 5 3.4纯化效果及纯化蛋白质分子量的测定 6 4 总结 7 参考文献 8 附 录 9  1 引言 胰蛋白酶 蛋白质标准曲线图 样品稀释了200倍，A595=0.116nm。根据y=1.0481x-0.0108得， 样品蛋白质含量为8.07mg/mL。 根据以上得出的结果，可知道样品蛋白质含量偏低,原因如下: ①样品透析之后仍具浑浊现象，表明该样品不纯。 ②标准曲线数据侧得有偏差。 ③调节pH值的时候并未达到那个要求，致使部分蛋白质耗失。 3.2胰蛋白酶的纯化 亲和层析平衡曲线图 通过与亲和层析法的典型溶离图谱做对比，得出以下结论： ①第一个波峰表明该收集液中主要为杂蛋白，而在第十根管的时候突然上升的原因是比色皿未清洗干净。 ②再经过洗脱后，第二个波峰表明该收集液主要为胰蛋白酶，这时候收集的两根收集液含有的胰蛋白酶较高，也就其纯度达到最大值。 ③所制得的曲线图谱与典型图谱相差不大，说明本实验较为合理，得到的胰蛋白酶较纯。 酶时间-光吸收关系 含量（mg/mL) 活力 比活力 纯化倍数 粗酶 2.6917 12333.333 22909.93 2.62 纯酶 0.0345 414.545 60078.99 根据以上计算所得的结果，可有以下结论： ①达到的纯化倍数相对很低，因为CHOM含杂蛋白比较多。 ②亲和吸附剂的制作转移过程中，耗掉了少量的吸附剂，以至于耗失少量的胰蛋白酶。 ③装柱与平衡时，收集的出口溶液，经紫外光分光光度计测定A280值并未小于0.01，稍大。 ④由于酶放置久其酶活力会下降。但是酶的纯度相对较高。 3.3酶活力的测定 利用米式作图法以及双倒数作图法，所制得的关于测定胰蛋白酶Km值与酶初速度v之间的关系图，如下： 米氏方程 双倒数法作图 根据以上图示T方程式y=0.0519x+0.1211,得， Km=2.11;Vmax=0.16μmol/(L·min) 抑制剂类型判断图 根据图中T1和T2的曲线做对比，可知道Km基本上不变，而Vmax是降低了。即该抑制剂类型为竞争性抑制。 3.4纯化效果及纯化蛋白质分子量的测定 纯化效果以及目的蛋白质分子质量大小以SDS表示如图： A1 A2 A3