人内皮抑素基因腺病毒表达载体构建及其在乳腺癌细胞中表达活.docVIP

人内皮抑素基因腺病毒表达载体构建及其在乳腺癌细胞中表达活 　 【关键词】 内皮抑素 腺病毒 基因治疗 抗血管治疗 乳腺癌 　　0 引言 　　近年来，阻止肿瘤血管生成，控制肿瘤的生长和转移，成为肿瘤治疗的一项新策略［1，2］，其中采用转染血管生成抑制剂拮抗血管的生成，以内皮抑素最为理想［3］。本文通过构建人内皮抑素基因的腺病毒表达载体，研究内皮抑素在乳腺癌细胞中的表达，为进一步研究乳腺癌的抗血管基因治疗做好准备。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　携带人内皮抑素基因（human endostatin,hE）的质粒pBlasthEndostatin购于美国InvitroGen公司；腺病毒载体pCA13、pBGHE3及293细胞株购于Microbix Biosystems公司；人乳腺癌细胞株MBD231和MCF7、人脐静脉内皮细胞株ECV304购于美国ATCC细胞库；LipofectAMINE2000转染试剂盒购自GibcoBRL公司；各种限制性内切酶和DNA连接酶购自NEB公司；QIAprep spin miniprepkit、QIAamp DNA Blood Mini Kit购自QIAGEN公司；MPER Mammalian Protein Extraction Reagent购自PIERCE公司；Western显色液LumiGLO chemiluminescent reagent and peroxide为Cell Signaling Technology公司产品；鼠抗人hE单克隆抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体购自武汉博士德公司；携带报告基因LacZ的增殖缺陷型腺病毒AdLacZ由东方肝胆外科医院病毒与基因治疗研究室保存。 　　1.2 腺病毒载体质粒pAdhE的构建 　　根据GenBank AF184060基因序列（555bp），在hE基因上下游分别设计引物，上游引物P1: 5CGGAATTCACCATGCACAGCCACCGC3’, 下游引物P2: 5GCTCTAGATTACTACTTGGAGGCAGT3’。引物上下游分别引入EcoRI和XbaI酶切位点。引物由上海基康生物技术公司合成。以pBlasthEndostatin为模板，P1、P2为引物，对hE基因进行PCR扩增，获得573bp大小的hE基因片段。插入pUC19质粒中，送上海基康生物公司测序。测序正确后，EcoRI＋XbaI酶切片段插入腺病毒载体pCA13的相应酶切位点，并通过PCR方法在hE基因上游引入M成瘤蛋白的信号肽，构建成功pAdhE。 　　1.3 携带hE基因的腺病毒AdhE的重组与鉴定 　　培养293细胞至对数生长期，采用Lipofectamine2000，将质粒pAdhE与pBGHE3(缺失188～1339bp的5型腺病毒)共转染至293细胞内进行同源重组。转染后10～14d出现病毒空斑，经病毒空斑纯化，应用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取腺病毒DNA，应用引物P1和P2进行PCR鉴定。鉴定正确者命名为AdhE。采用293细胞进行病毒的扩增，以氯化铯梯度离心进行病毒纯化，测定病毒滴度。 　　1.4 免疫荧光和免疫印迹检测hE在乳腺癌细胞中的表达 　　在6孔板上接种人乳腺癌细胞株MBD231和MCF7，1×104个细胞／孔，以重复感染度（MOI）为10的感染强度，感染重组病毒AdhE。继续培养48h后，收集细胞。取少量细胞悬液滴在玻片上，进行免疫荧光标记，荧光显微镜下观察hE的表达。其余细胞以MPER Mammalian Protein Extraction Reagent裂解后回收蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝胶中70V恒压电泳，分离蛋白质，3V，90mA条件下用电转移仪将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，进行Western Blot检测。 　　1.5 重组腺病毒表达hE的活性鉴定 　　以ECV304为靶细胞，接种至6孔板中培养，1×105个细胞/孔，培养24h。以MOI＝100、10、1、0.1、0.01、0分别感染重组腺病毒AdhE或AdLacZ后继续培养，在病毒感染后第3d, 用10%结晶紫福尔马林溶液固定10min，龙胆紫染色。 　　　2 结果 　　2.1 腺病毒载体质粒pAdhE及重组腺病毒AdhE的鉴定 见图1A～1B 　　图1 腺病毒载体质粒pAdhE及重组腺病毒AdhE的鉴定（略） 　　A: 质粒EcoRI＋XbaI双酶切，1 pCA13；2 pAdhE；3 Lambda DNA／EcoRI＋HindIII。B：重组病毒PCR扩增，1 100bp DNA Ladder；2 AdhE；3 阴性对照；4