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含RIZ1 PR结构域融合蛋白原核表达、提纯及功能分析 　［摘要］目的:表达与提纯RIZ1第1个至第200个氨基酸含PR结构域的活性GST融合蛋白质（GSTPR200融合蛋白）。方法:设计引物以含人RIZ1 cDNA全序列的pRIZ1 RH质粒为模板克隆获得目的基因片段，测序核对后经EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切，以正确阅读框架插入相同酶切的pGEX6P3中，经转染与IPTG诱导表达筛选到阳性大肠杆菌克隆并提纯该融合蛋白质。分别采用SDSPAGE蛋白电泳法、质谱分析法及组蛋白甲基化转移酶（HMT）测定法鉴定其性质与功能。结果：获得的纯化融合蛋白质相对分子质量约为47 000，其CPM值明显高于对照组（Plt;001），且与作用时间呈正相关。结论:所构建的融合蛋白原核表达系统能有效表达活性GSTPR200融合蛋白，可供大量提取作进一步研究。　　［关键词］RIZ1蛋白；PR结构域；表达载体；组蛋白甲基化作用 　　RIZ1是功能性筛选能与视网膜母细胞瘤（RB）肿瘤抑制因子相结合的蛋白质时分离出来的基因。已发现由于不同启动子的作用，RIZ1可以表达两种蛋白产物，即氨基端含有PR结构域的全长产物RIZ1（1719个氨基酸），以及除缺少RIZ1氨基末端200个氨基酸（包含PR结构域）外其余序列与RIZ1完全相同的RIZ2［1］。研究表明，RIZ1而非RIZ2具有肿瘤抑制特性。一般来说，RIZ1定位于人染色体1p36，为多种不同类型人癌组织所缺失［2］。许多人类肿瘤，如肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤、肺癌、黑素瘤、骨肉瘤的组织中出现RIZ1而非RIZ2表达沉默［35］。我们初步研究也发现，人乳腺癌组织中存在RIZ1 mRNA表达的改变［6］。人癌组织和细胞株中RIZ1错义失活性突变均出现在PR结构域内或其附近［7］。在乳腺癌细胞系、肝癌细胞系中由腺病毒介导的RIZ1表达可以造成细胞G2M期阻滞和（或）细胞凋亡［35］。更重要的是基因敲除鼠若无RIZ1表达而仅有RIZ2表达，则易发生胃癌和B细胞淋巴瘤［7］。通过以上研究可以确定PR结构域与肿瘤的发生有直接联系，因此，目前认为RIZ1抑制肿瘤的作用与其PR结构域有关。为了更好地研究RIZ1 PR结构域的功能与结构，我们采用基因工程技术合成并提纯了RIZ1氨基末端含PR结构域的200个氨基酸的融合蛋白，并初步探讨了其体外功能，现报道如下。 　　1 材料与方法 　　11 材料pRIZ1 RH质粒由本研究组保存；原核表达载体质粒pGEX6P3购自Amersham Biosciences公司，是一种融合蛋白表达载体，含一个可编码谷胱甘肽S转移酶(GST)的读码框架，其下游有多克隆位点，插入符合相应读码框架的外源基因片段，在IPTG的诱导下可表达出与GST相融合的蛋白质；大肠杆菌CM1061菌株（购自New England Biolabs）、大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株（购自EMD Bioscienses）由本课题研究组保存；Pfu DNA聚合酶等PCR试剂购自Stratagene公司；PCR产物纯化试剂盒(QIAquick PCR Purification Kit)、大量质粒提取试剂盒(QIAGEN Plasmid Maxi Kit)为QIAGEN公司产品；限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ购自Fermentas公司；T4 DNA连接酶购自New England BioLabs公司； Glutathione Agarose吸附柱购自Sigma公司；人组蛋白 H3购自upstate公司；AdenosylLMethionine，S［methyl3H］ 购自PerkinElmer公司；BioRad蛋白测定试剂盒购自BIORAD公司。 　　12 PCR引物的设计与合成目的基因为含PR结构区的PR200基因片段,位于RIZ1全基因序列的第1~600个核苷酸(nt1600)。通过GenBank检索RIZ1的cDNA序列，采用DNA Star软件设计PCR引物，上游引物（GSTPR200P1）序列为：5′ACCGAATTCCATGGAAGTGAGGCTTTTCCCTTC3′，含EcoRⅠ酶切位点及启始密码子；下游引物（GSTPR200P2）序列为：5′CTCCTCGAGTCATTATGCAGAG GTGAAATCTGGCT3′，含终止密码子及XhoⅠ酶切位点。引物由Invitrogen公司合成。 　　13 目的基因的PCR扩增以 pRIZ1 RH质粒为模板，以GSTPR200 P1、GSTPR200 P2为引物，采用Pfu DNA聚合酶PCR扩增目的基因。阴性对照以等量去离子水代替模板。其反应条件为：95℃ 13min 热启动；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，30个循环；最后72℃延伸10mi