四环素及其衍生物诱导表达pTetOn肺癌细胞系A549建立.docVIP

四环素及其衍生物诱导表达pTetOn肺癌细胞系A549建立 　 作者：曹晓敏 林仲秋 庞战军 全松 邢福祺 【摘要】 目的：构建可受四环素诱导调控的高表达外源基因的真核表达体统A549 pTetOn细胞系。用于F10基因的功能研究。方法：将pTetOn质粒用脂质体介导法转染A549细胞, 利用G418的药物选择特性, 对转染的A549细胞进行压力筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化, 单克隆分别扩增后, 瞬时转染pTREluc(编码荧光素酶蛋白)质粒, Dox诱导表达后, 检测荧光素酶活性, 逐一筛选四环素调控高表达外源基因的A549 pTetOn细胞株。结果：成功构建了一株受Dox调控的高表达低背景的A549 pTetOn细胞株。结论：筛选的A549细胞为F10基因表达能被pTeton诱导表达系统调控的细胞系, 为研究F10基因功能提供了理想的细胞模型。适合在此基础上对F10基因进行深入的研究。 【关键词】 四环素; F10基因; 基因调控 F10基因是新克隆的在葡萄胎中表达上调的功能未知的新基因［1］，在大多数基因 治疗 或研究基因功能时, 多数转基因都是持续表达的, 没有表达量和表达时间的调控。很多情况下, 这种持续表达外源基因不论是基因功能研究还是基因治疗都存在很大局限。pTetOn基因表达系统是1992年Gossen［2］等设计的一种受四环素调控外源基因表达的高效真核表达体系，该系统有两种表达质粒即调节质粒和反应质粒组成, 调节质粒可表达一种融合蛋白称四环素反应转录活化因子(Tetresponsivetranscriptionalactivator,tTA), 该因子可与反应转录的四环素反应性元件(Tetresponsiveelement,TRE)结合。在没有四环素(tetracycline)或其衍生物强力霉素存在的情况下, 引起插入启动子下游目的基因的高效表达。随着四环素浓度的增加, 基因的表达以一种剂量依赖性的方式逐渐关闭直至为零。1995年Gossen等通过改变tTA的氨基酸顺序构建了受四环素正性调节的基因表达系统, 称Teton基因表达系统。该系统受四环素的作用刚好与Tetoff系统相反, 即在没有四环素的情况下表达水平为零。而在加入四环素或强力霉素后目的基因高效表达。Tetoff、Teton基因表达系统被认为是目前最为理想的真核生物基因表达系统。与目前所有的真核基因表达系统比较, 该系统具有严密性、特异性、高效性等优点［3］。基于此系统的工作原理，我们将pTeton基因表达系统的调节质粒pTeton转染到A549细胞系，筛选得到稳定克隆后，再导入报道质粒pTRELuc, 通过检测荧光素酶的活性，筛选、建立了一株能高水平诱导、低背景表达的A549细胞系，为下一步研究F10基因的定量表达在肿瘤的发生、 发展 中的作用提供理想的细胞模型。 毕业论文 1 材料与方法 1.1 质粒 毕业论文 pTetOn 、pTRELuc、DOX、Lipofectamin2000、无四环素污染的胎牛血清购自Clongtech公司。G418、DMEM购自Gicol公司，Luciferase Assay System为Promega公司的产品。 1.2 细胞系及培养条件 论文代写 肺癌细胞系A549（广州医学院医学实验中心保存、复苏）培养于含10%胎牛血清的RPMI1640的培养基中，在37℃、5% CO2条件下培养。 论文代写 1.3 建立表达pTetOn的稳定克隆 论文代写 Lipofectamin2000介导的稳定转染：转染前24h细胞种于6孔板（2mL含15%小牛血清的RPMI1640/孔），待细胞生长至90%～95%的融合度时开始转染。转染时备两个Eppendorf管，每管加入250μl无血清的RPMI1640培养液，其中的一管再加pTetOn质粒3μg,另一管加入Lipofectamin2000 8μg，待Lipofectamin2000室温孵育5min后，混合两管，室温放置5min。然后将500μl混合液加于2mL完全培养基6h, 更换培养基继续培养至克隆形成, 挑选单克隆，经过96孔、24孔及12孔细胞培养板传代至25ml培养瓶，然后扩大培养备用。 1.4 质粒pTRELuc瞬间转染A549细胞 用有限稀释法将稳定转染pTetOn的A549克隆(A549 pTetOn)单克隆化。用0.25%胰酶消化A549 pTetOn克隆, 制成30个/ml的细胞悬液接种于10块96孔板, 每孔接种100μl细胞悬液。2周后挑选生长状况良好的单克隆(克隆编号)从96孔板逐步扩增