细菌内毒素本法利用鲎试剂从鲎——Limuluspolyhemus或.DOCVIP

2.6.14 细菌内毒素 本法利用鲎试剂（从鲎——Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus——血细胞提取物（amoebocyte lysate））））））））C = 50 mg/ml, K = 5 IU内毒素每千克体重每小时， λ = 0.4IU内毒素每毫升 在该产品的日常检验中，将1ml供试品溶液稀释至20ml是方便的做法（MVD/2后，得到的值取最接近的较小的整数）。但是，如果以该稀释倍数稀释供试品，得到的检查结果呈阳性且可疑的话，检验员有必要将1ml稀释至41.67ml。 参照标准品 内毒素标准BRP说明了参照标准品的制备方法。它已用内毒素WHO国际标准品测定了含量，它的效价单位以内毒素国际单位/安瓿表示。内毒素国际单位定义为一定量的国际标准品的活性。 就日常使用而言，也可使用另一种内毒素制剂，只要选用的内毒素制剂已用内毒素国际标准品或BRP标准品测定了含量，且它的效价单位以内毒素国际单位表示。 注：1国际单位（IU）等于1内毒素单位（E.U.）。 BET用水 基于实践和理论原因，用家兔热原检查法衍生的方法来检查试剂中内毒素的含量是不可取的，因为： 4.1用于对产品开展测试的BET检查用水的内毒素含量限值相当低，家兔检查法的灵敏度不足以检测BET检查用水的内毒素。 4.2家兔体温的升高的精确度相对较低，因此需要在多只家兔身上开展平行试验。 4.3“热原”和“内毒素”所指物质的涵盖范围并不完全重合。 根据细菌内毒素检查法的具体内容，可以看出BET检查用水的制备方法并不是三次蒸馏。在这里，使用反渗透技术的优势很明显，也有些检验员认为蒸馏次数大于三次是较好的方法。不论使用哪种方法，得到的产物不能检测出内毒素。 混合物的pH值 检查细菌内毒素时，pH值在6.0-8.0之间时，获得的凝胶最为理想。不过，要注意的是，供试品中添加的鲎试剂可能会导致pH值的降低。 鲎试剂的验证 在这一点上，按照生产商的说明制备鲎试液非常重要。 凝胶法中，A和B的阳性结果的反应终点的稀释倍数需要转换成对数形式，原因如下：如果对这些对数值的分布频率作图，得到的曲线通常更接近正态分布曲线，而不是稀释倍数的分布频率曲线；这两条曲线非常相似，以至于可以使用正态分布曲线作为数学模型、利用Student’s t-检验来计算置信限。 干扰因素的预备试验 有些产品不能与试剂混溶，不能将它们的pH值调节至6.0-8.0之间，甚至有些产品本身就能抑制或激发凝胶反应，因而不能直接检测它们的内毒素含量。考虑到这些问题，需要事先开展干扰因素试验，确定供试品是否能形成这些干扰。如果检验员发现了这些干扰因素，接下来必须证明这些干扰因素的排除方法的有效性。 预备试验的目的是在供试品存在和不存在两种情况下，检查鲎试剂的灵敏度是否有明显差异，即检查零假设是否成立。方法A和B中对此有项简单的判定标准：如果在存在供试品的情况下，鲎试剂的灵敏度与不存在供试品的情况下的灵敏度的比值在0.5-2之间，可判定零假设成立。 Student’s t-检验法是处理这个问题的经典方法，它能计算存在与不存在供试品时的稀释倍数的对数值的平均值，检查这两个平均值的差异，从而实现了检查鲎试剂的灵敏度的目的。 凝胶法A和B的干扰因素试验要求供试品的内毒素不可检出。因此，全新的产品必须检测内毒素，这是理论上的要求。此外，方法C、D、E、F为定量方法。 干扰因素的排除 排除干扰因素的方法不得对供试品的内毒素的含量造成增减（例如吸附）。检查的正确做法是，使用供试品的加标样（即添加了已知量内毒素的样品），然后计算内毒素的回收率。 方法C和D。如果供试品的性质使得经典方法的应用不能排除干扰因素，可用适当方法或稀释法去除供试品的内毒素，再绘制标准曲线。检查内毒素时，可将检查结果与标准曲线比较，达到检查的目的。 用三醋酸纤维素非对称膜进行超滤是大多数情况下都适用的方法。在某些情况下，纤维素的衍生物（β-葡聚糖）可导致假阳性结果的出现，因此，过滤装置需要适当验证。 经证实，聚砜膜过滤装置不适用于该项检查；某些使用者发现该方法会导致假阳性结果。 对照品的用途 制备BET检查用水制成的对照品和用内毒素参照标准品制成的浓度为鲎试剂标示灵敏度的两倍的对照品，其目的在于验证鲎试剂在试验条件下和试验当时的活性。制备阴性对照品的目的在于验证BET检查用水不可检出内毒素。 阳性对照品所含的内毒素浓度与待检供试品所含的内毒素浓度一致，它的试验结果能证明在试验条件下和试验当时，不存在干扰因素。 结果判断和解释 检查时，尽管BET检查用水或其他试剂、材料在试验过程中会与鲎试剂接触，只要它们携带的微量内毒素没有达到鲎试剂灵敏度的限值，就不能被检测出来。但是，它们携带的内毒素可能会导致供试品溶液中内毒素含量的增大，甚至