复方中草药肉鸡饲料添加剂抑菌及毒理学试验.docVIP

复方中草药肉鸡饲料添加剂抑菌及毒理学试验 复方中草药肉鸡饲料添加剂的抑菌及毒理学试验 随着肉鸡饲养方式从散养型向规模化转变，其密度增加了1倍，密度的增加使发病率增加4倍以上。为保障肉鸡的存活率，饲料添加剂的使用量逐渐增加，为肉鸡养殖业的健康发展做出巨大贡献的同时，也衍生出不少问题。饲料添加剂含有抗生素类药物，可以提高肉鸡的存活率和产量，但鸡肉中药物残留的提高，直接危害了人类健康[1-3]。随着人民生活水平的提高，人民的健康保健意识显著增强，消费者对鸡肉的品质和安全性等方面的要求越来越高，低脂药残少的鸡肉成为消费者的首选。基于上述需求，开发一种既能提高肉鸡存活率和产量，又能改善鸡肉品质的饲料添加剂迫在眉睫，中草药无毒副作用、无抗药性、无污染、无残留，且多为常见药物，价格低廉，优于抗生素，因而成为人们研究开发的首选对象[4-8]。本研究在单味中草药对肉鸡养殖常见菌抑菌和饲喂研究的基础上，依据中药配伍的原理，配制3剂中草药复方制剂，并对其进行抑菌试验、毒理试验，筛选出效果最好的中草药复方制剂，进行饲喂试验，旨在为研制应用于实际肉鸡养殖业的复方中草药肉鸡饲料添加剂奠定理论基础。 　1材料与方法 　1.1试验试剂 　根据单味中草药的抑菌效果和病原菌种类，结合中医药理论，配制出3剂中草药复方制剂，分别为制剂Ⅰ、制剂Ⅱ、制剂Ⅲ[9]，配方如下。 　制剂Ⅰ：桂皮40%、小茴香30%、肉桂10%、陈皮10%、甘草10%，水煎取汁；制剂Ⅱ：黄芪40%、肉桂30%、贯众10%、何首乌10%、甘草10%，水煎取汁；制剂Ⅲ：金银花40%、黄芪30%、茯芩10%、陈皮10%、甘草10%，水煎取汁。 　其他试剂有：琼脂培养基、鲜血琼脂培养基、无菌营养肉汤、抗鸡红细胞抗体、蒸馏水、无菌生理盐水、小牛血清淋巴细胞分层液、0.8%戊二醛溶液、苏木精和伊红染色液。 　1.2试验动物 　试验动物为昆明种小白鼠。 　1.3试验仪器 　试验用仪器主要有：牛津杯、培养皿、TDL-40B低速台式水平离心机、低温冰箱、电热恒温水浴箱、OLYMPUS显微镜等。 　1.4抑菌试验方法 　1.4.1药敏性试验采用牛津杯加注药液的体外抑菌法。将12 cm灭菌培养皿分成6个扇区。将琼脂培养基和鲜血琼脂培养基倒平板，在每个平皿内均匀加入0.5 mL已制备的病原菌稀释菌液。将牛津杯按顺序放入6个扇区中央，杯内加入100 mu;L药液，37 ℃培养24 h，观察结果，并测量抑菌直径。中草药及复方的醇提物按同样方法进行体外抑菌试验[10]。 　1.4.2最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC） 的测定根据水提物、醇提物抑菌结果，采用10倍稀释法及2倍稀释法，测定MIC和MBC。（1）10倍稀释法：用无菌营养肉汤倍比稀释药液（终体积5 mL），使药液浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4等4个梯度（同时以无菌生理盐水作空白对照，不接种菌液作阴性对照）；接种病原菌稀释菌液20 mu;L，摇匀；37 ℃ 培养24 h。以不显示浊度、细菌未生长时的药物浓度作为MIC，并取该管中0.05 mL 肉汤，接种于营养琼脂平板；37 ℃ 培养24 h，平板上无菌落或菌落生长数le;10的药物浓度为MBC[10]。（2）2倍稀释法：根据10倍稀释法结果，进一步确定MIC和MBC。无菌营养肉汤倍比稀释药液，浓度梯度为1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256、1 ∶512；MIC和MBC判定同10倍稀释法[10]。 　1.5毒理学试验方法 　1.5.1急性毒性试验（LD50的测定） 根据此前预试验结果，设20 000、30 000、45 000、67 500 mg/kg 4个剂量组（等比级数1.5）和1个空白对照组。取18～22 g小白鼠，每组10只，雌雄各半，连续给药7 d，每天观察小白鼠精神、食欲、饮水、活动及中毒情况，并记录小白鼠的死亡数目[11-12]。 　1.5.2蓄积毒性试验（20 d蓄积试验法）取体重15～18 g的小白鼠，每组10只，雌雄各半，设4个剂量组和1个对照组，按1 000、2 000、4 000、8 000 mg/kg的剂量进行灌胃给药，连续给药20 d，在给药期间观察小白鼠的精神、食欲、饮水、死亡情况和有无异常反应。给药停止后观察7 d内小白鼠的死亡情况及体重的变化[11，13]。 　1.5.3微核试验取体重为18～22 g的成年小白鼠，每组10只，雌雄各半，设3个试验组，1个阳性对照组和1个阴性对照组。试验组按1%、2%、3%的剂量将中草药饲料添加剂混入饲料中饲喂，阳性组用环磷酰胺100 mg/kg腹腔注射。试验组和对照组均采用2次染毒法，间隔时间为24 h，