外周血MUC1基因表达及食管癌微转移关系.docVIP

外周血MUC1基因表达及食管癌微转移关系 　 作者：施舜缤，俞力超，胡嘉波，朱孝中，许文荣 【关键词】 食管癌; 黏蛋白; 微转移; 逆转录聚合酶链反应 　　1 资料与方法 1.1 病 例 无转移组:选择2006年1月至2006年5月我院病理确诊为食管鳞癌而经B超、CT或术中探查未发现有远处转移的患者53例。转移组:同一时期病理确诊为食管鳞癌，又经B超、CT或术中探查明确发现有远处转移的患者10例。良性对照组:同一时期的食管炎7 例,贲门失弛症2例,食管烧伤1例。 1.2 标本采集和处理　 无转移组、对照组所有患者于采集标本前均未行任何针对肿瘤的治疗,采外周血(采集标本均需肝素抗凝),先抽出1 ml弃去,再留取5 ml。红细胞裂解液裂解红细胞， 分离有核细胞，液氮速冻后，-80℃保存备用。 1.3 方 法　 采用Trizol试剂提取细胞总RNA, 所提RNA经1％琼脂糖电泳鉴定。以1 μg为模板,以OligodT作引物,置于70℃温浴5 min后,冰浴2 min,再加入逆转录酶、dNTP等,在42℃温浴1.5 h合成cDNA, 94℃灭活逆转录酶及预变性5 min，以cDNA为模板进行PCR 扩增。MUC1基因引物设计序列如下［2,3］(外引物A和B,内引物C和D,产物分别为510 bp，287 bp) A:5′ATGCCAGTAGCACTCACCATAG3′；B:5′CAGCCAAGGCAATGAGATAGAC3′;C:5′CGTCGTGGACATTGATGGTACC3′；D: 5′GGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA3′。β肌动蛋白作为内对照标准,引物序列E:5′TCATCACCATTGGCAATGAG3′；F:5′CACTGTGTTGGCGTACAGGT3′，产物为154 bp。引物均由上海生工生物工程技术服务公司合成。巢式RTPCR扩增条件：第1次，94℃ 90 s后,94℃ 15 s，55℃ 30 s，68℃ 45 s 循环35次；68℃终延伸5 min，扩增产物510 bp。第2次，94℃预变性90 s，94℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，循环30次；72℃终延伸2 min。配制1.8%琼脂糖凝胶,产物电泳,经溴化乙啶(EB) 显色得到特异性条带者为阳性检出。 1.4 统计学分析　 应用SPSS11.0软件进行统计分析，采用χ2检验, Plt;0.05为有差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 总RNA鉴定 经过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,18 S和28 S条带清晰可见，见图1。 　　2.2 各组之间阳性率比较　 以β肌动蛋白的RTPCR扩增产物量为依据，调整巢式RTPCR 模板量，标本MUC1表达结果见图2。良性对照组10例外周血中无MUC1 mRNA阳性表达。无转移组MUC1 mRNA 阳性检出率为39.6%(21/53),转移组MUC1 mRNA阳性检出率90.0%(9/10),结果见表1，各组间差异有统计学意义(χ2=6.66, Plt;0.01)。表1 患者术前外周血MUC1 mRNA的检测结果（略） 2.3 无转移组阳性分布与病理分化程度的关系 不同病理分化程度之间的MUC1 mRNA阳性检出率差异无统计学意义(Pgt;0.05)。结果见表2。表2 无转移组术前外周血中MUC1 mRNA检测 阳性分布与病理分化程度的关系（略） 　　2.4 食管癌患者阳性表达与国际TNM分期的关系 MUC1 mRNA阳性率随TNM分期升高而升高。但Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ期之间相比检出率差异无统计学意义(Pgt;0.05)；而Ⅳ期与Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ期相比阳性检出率差异有统计学意义(Plt;0.05)。见表3。 　　　3 讨 论 肿瘤微转移一般指恶性肿瘤细胞播散于淋巴结、骨髓、外周血及其他组织器官中，尚未形成转移性结节,无任何临床表现，常规方法难以发现和检测到的转移［4，5］ 。肿瘤临床转移一般都由微转移发展而来，对肿瘤微转移的检测是临床判断治疗效果、预示肿瘤复发的有效手段。有关食管癌的微转移研究起步较晚,一般局限于食管癌淋巴结的微转移方面［6，7］。外周血液的微转移研究较少，有证据表明食管癌患者外周血循环中也存在肿瘤细胞，提示食管癌患者并非中晚期才发生血性转移［8，9］。早期发现肿瘤微转移对肿瘤的分期、复发、预后有重要的意义。表3 食管癌患者术前外周血中MUC1 mRNA检测阳性分布与国际TNM分期的关系（略） 常规RTPCR技术一般1 ml全血中含有100个肿瘤细胞以上时才可能被检测出。采用巢式RTPCR