小鼠OCILrP2基因克隆、 原核表达及抗血清制备.docVIP

小鼠OCILrP2基因克隆、 原核表达及抗血清制备 　 ; 作者：靳迪 ;饶恩于 李景鹏 赵勇 毕业论文 【关键词】; 小鼠OCILrP2;,原核表达;,抗OCILrP2抗血清 毕业论文 　　[摘 要]; 目的: 在原核系统中表达破骨细胞抑制凝集素家族成员之一OCILrP2基因, 并制备大鼠抗OCILrP2的抗血清。方法: 应用RTPCR从小鼠脾细胞中克隆的部分OCILrP2 cDNA, 构建重组表达载体pET28aOCILrP2, 并转化大肠杆菌BL21(DE3), 以IPTG诱导表达HisOCILrP2融合蛋白。以表达产物免疫SD大鼠, 制备大鼠抗OCILrP2的抗血清。采用Western blot测定其效价和特异性。结果: RTPCR法扩增出235 bp的OCILrP2基因, 其cDNA序列与GenBank中登录的序列一致。以构建的重组质粒pET28aOCILrP2转化大肠杆菌获得目的蛋白的高表达。以表达的HisOCILrP2融合蛋白免疫大鼠获得抗小鼠OCILrP2的抗血清。Western blot分析表明, 该抗血清均可与原核表达的HisOCILrP2融合蛋白和真核表达的OCILrP2Ig融合蛋白特异性结合; 抗血清的效价为1∶2000。结论: 在原核细胞中表达了小鼠的OCILrP2蛋白, 制备了大鼠抗小鼠OCILrP2的抗血清, 为进一步研究OCILrP2的生物学功能奠定了基础。 毕业论文 　　[关键词]小鼠OCILrP2; 原核表达; 抗OCILrP2抗血清 ; 　　破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2（osteoclast inhibitory lectinrelated protein 2, OCILrP2）是破骨细胞抑制凝集素（OCIL）家族的成员之一, 属于Ⅱ型跨膜糖蛋白, 具有1个较小的胞内区, 胞外区含有1个C型凝集素结构域。小鼠OCILrP2基因位于6号染色体的NK基因复合体内。此复合体存在很多C型凝集素相关基因, 包括CD69、 NKG2家族及Ly49家族及NKRP1家族等。OCIL家族包括OCIL(Clrb)、 OCILrP1(Clrd)和OCILrP2(Clrg)3个基因, 其胞外区具有很高的同源性(约80%)[1]。OCILrP2主要在免疫系统中表达, 其中在B细胞和树突状细胞（DC）中呈高表达; 在未活化的CD4+和CD8+ T细胞中有微量表达, 但T细胞活化后, 其表达上调。最近发现, OCILrP2为NK细胞受体蛋白1（NKRP1）家族成员中NKRP1F的配体[2]。研究表明, OCILrP2也可作为T细胞的共刺激分子, 在T细胞的活化过程中起作用[3, 4]。因此, 需要进一步研究OCILrP2在T细胞中的作用机制, 在B细胞、 DC中可能的功能, 以及其与NKRP1F相结合后对NK细胞功能的影响。本研究中用RTPCR克隆并在原核细胞中表达OCILrP2基因, 以表达的蛋白为免疫原制备大鼠抗OCILrP2的抗血清, 为进一步研究OCILrP2的功能提供了重要的试剂。 毕业论文 　　1; 材料和方法 毕业论文 　　1.1; 材料; Trizol试剂为Invitrogen公司产品。RTPCR试剂盒、 EcoRⅠ、 XhoⅠ和T4 DNA连接酶均为TaKaRa公司产品。质粒提取试剂盒、 DNA胶回收试剂盒为博大泰克公司产品。弗氏完全与不完全佐剂购自欣经科公司。HRP化学发光底物为Pierce公司产品。HRP标记的羊抗大鼠IgG为Sigma公司产品。蛋白marker购自华美公司。DNA marker购自鼎国公司。C57/B6小鼠及SD大鼠购自维通利华公司。原核表达载体pET28a及E.coli BL21（DE3）由本实验室保存。 毕业论文 　　1.2; 方法 毕业论文 　　1.2.1; 小鼠OCILrP2基因的克隆及重组表达载体的构建; 以C57/B6小鼠脾细胞中提取的总RNA为模板, 用Oligo4进行逆转录反应合成cDNA第1条链, 再以上游引物（P1）5′AAAGAATTCTGGAAGTGGACAAACAACAC3′（含EcoRⅠ酶切位点）和下游引物（P2）5′AATCTCGAGGACCATAGGGGAAAAAGTAG3′（含XhoⅠ酶切位点）进行, PCR扩增OcilrP2的部分cDNA。回收PCR产物（约为250 bp）, 用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后, 连接到表达质粒pET28a中的EcoRⅠ和XhoⅠ位点之间, 构建重组质粒pET28aOcilrP2。以重组质粒经转化大肠杆菌BL21（DE3）后, 提取重组质粒, 经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后, 送上海博亚公司测序。 毕业论文 　　1.2.2; 重组HisOCILrP2融合蛋白的诱