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小鼠肾脏发生发育中神经型一氧化氮合酶定量分析 　 作者：刘霞 包翠芬 张晓明 穆长征 【摘要】 　　目的： 对生后小鼠肾脏发生发育不同阶段中神经型一氧化氮合酶（nNOS)的表达进行定量分析，探讨nNOS在小鼠生后肾脏发育中的意义。方法： 分别取新生（出生小于2h）、生后3、5、7、14、40天昆明小鼠各8只，共6组,用免疫印迹技术和光密度分析方法对各组小鼠生后肾神经型一氧化氮合酶进行定量检测，以测得的一氧化氮合酶最大量为 1( 100% ) ,计算蛋白相对含量， SPSS10. 0统计软件包统计分析。结果： 新生组酶含量最高为100%, 随年龄增长酶含量逐渐减少，至成年达到最低水平为44.8±2.4% 。 结论： 这一趋势表明nNOS可能在小鼠生后肾脏发育的早期阶段起重要调节作用。 【关键词】 小鼠 ; 肾 ; 神经型一氧化氮合酶 　　一氧化氮（NO）作为体内重要的信使分子和效应分子，在调节肾脏血流动力学方面具有重要的作用。肾脏中的NO主要由一氧化氮合酶（NOS）催化产生。NOS有三个亚型，即神经型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)［1］。目前对肾发生发育过程中NO和 NOS的研究还刚刚起步 ,本实验通过定量方法检测生后小鼠的发生发育不同阶段nNOS的含量，旨在探讨nNOS在小鼠肾脏发生发育中的意义。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验动物与分组 　　成年健康昆明小鼠（辽宁医学院实验动物中心提供）。根据小鼠孕程确认仔鼠出生时间 ,取新生（小于2h）、3、5、7、14、40天小鼠各8只，共6组。 　　1.2 主要试剂 　　nNOS兔抗鼠多克隆抗体（北京中杉公司）；细胞裂解液、丙稀酰胺、N，N亚甲基双丙稀酰胺、甘氨酸、Tween20、TritonX100、Trisbase、SDS和PVDF膜（SIGMA公司）。 　　1.3 Western blot步骤 　　各组小鼠麻醉后剖腹取右肾,PBS冲洗,迅速置于液氮冷冻,-70℃冰箱保存。取冷冻肾组织,加入3倍体积的细胞裂解液,0℃下剪碎、匀浆,将组织匀浆液静置30min,4℃,12000rpm 离心10min,留取上清液。用Bradford法测定蛋白含量,分装成每离心管中含10μg蛋白,-20℃冰箱保存。 　　配制10%分离胶和5%浓缩胶,取10μg(30μl)肾组织蛋白细胞裂解上清液,加入10μl SDS样品缓冲液,100℃加热3min,离心。取上述裂解液加入电泳胶样品槽,100V电压下电泳,待样品到达合适位置,停止电泳，将胶板取下,转膜液洗涤10～30min。将胶与0.45μmPVDF膜(用前置于甲醇内浸透5min左右，再放入转膜液中至少5min)置于厚滤纸(已用转膜液浸泡)之间,赶尽气泡,常温下半干转印,转印完成后将PVDF膜用TBST(TBS1%Tueen20溶液)冲洗,5%脱脂奶粉溶液室温封闭1～2h。与一抗(兔抗小鼠nNOS抗体,稀释度为1∶400)4℃孵育过夜,TBST洗脱3次,每次至少5min； 再与二抗(碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体,稀释度为1∶200)室温孵育1h,TBST溶液洗脱3次, 每次至少5min；NBT/BCIP显色；扫描电泳条带,输入电脑,用光密度分析软件分析电泳条带光密度。 　　1.4 统计学分析 　　SPSS10.0统计软件包统计分析，组间比较采用 q检验，以 Plt;0.05为有统计学意义，Plt;0.01为有明显统计学意义。 　　2 结果 　　生后小鼠肾脏发生发育不同阶段 nNOS含量分析 Western blot电泳条带图显示新生小鼠nNOS含量最高，随着肾脏发生发育逐渐降低，到成年降低至最低水平。光密度分析显示：以测得的nNOS最大量为1,计算各组nNOS表达相对含量（百分数）。新生小鼠nNOS含量最高（100%），出生后3天降低，生后5天进一步降低，到成年降至最低水平。见表 1。 　　　表1 小鼠生后不同阶段肾脏nNOS表达的光密度百分数（略） 　　注：*与成年组比较,Plt;0.01；#与新生组比较,Plt;0.05。 　　3 讨论 　　本实验表明生后小鼠发生发育不同阶段中，新生小鼠肾脏的nNOS含量最高（Plt;0.05）。nNOS是一种结构酶，其表达越多，则可能产生NO越多，作为新生小鼠体内唯一的血管舒张因子，通过对抗高活性血管收缩因子特别是血管紧张素Ⅱ的作用，可增加肾血流量（RBF）及肾小球滤过率（GFR），调节肾脏正常的生理活动［2］。生后小鼠早期阶段高肾血管阻力（RVR）、低RBF、低GFR的生理特点是促使nNOS表达的主要因素，可见nNOS在肾脏功能发育的早期对肾血液动力学的调节起着重要作用。此外nNOS的表达还与细胞自身的生长发育与