弓形虫三磷酸核苷水解酶基因克隆及序列分析.docVIP

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因克隆及序列分析 　【摘要】 目的:克隆并分析我国刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶（NTPase）的编码基因。方法:采用聚合酶链反应（PCR）扩增弓形虫RH株的NTPase基因，克隆入pGEM-T Easy载体，转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定，并对获得的NTPase基因及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果:PCR扩增得到特异的弓形虫NTPase基因序列，测序结果表明，获得的弓形虫NTPase-Ⅱ基因全长1 812 bp，编码的603个氨基酸与Genebank报道的氨基酸序列同源性为100%。经DNAStar预测NTPase-Ⅱ存在6个潜在抗原表位。结论:成功克隆出序列正确的弓形虫NTPase-Ⅱ基因，为其相关研究奠定了基础。 【关键词】 弓形虫 核苷水解酶 克隆 序列分析 Abstract: Objective:To clone and analyze the nucleoside triphosphate hydrolase (NTPase) gene of Toxoplasma gondii. Methods: The NTPase gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from RH strain of Toxoplasma gondii and cloned into pGEM-T Easy vector. Positive clones were screened and identified by BglⅡ、HindⅢ digestion and sequenced. The DNA sequence and its deduced protein sequence were analyzed. Results: The NTPase gene was specifically amplified, DNA sequence analysis showed that the length of cloned gene was 1 812 base pair. The homology of this deduced amino acids sequence was 100% to that in the Genebank. Conclusion: The NTPase-Ⅱ gene is successfully cloned, providing basis for the future research about this gene. Key words: Toxoplasma gondii; NTPase; cloning; sequencing 刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是专性细胞内寄生的机会致病性原虫，呈世界性分布。三磷酸核苷水解酶（nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase）为分布于弓形虫速殖子表面一种主要特异性抗原[1，2]，其对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用[3]。目前，国内关于弓形虫病诊断和疫苗候选抗原的研究主要集中在P30（SAG1）和P22抗原[4-6]，而对NTPase的研究鲜见报道。因此，我们对弓形虫RH株的NTPase基因进行扩增与克隆，为下一步的研究奠定基础。 1 材料和方法 1.1 虫株和试剂 弓形虫RH株由浙江省医学科学研究院寄生虫病研究所惠赠；E.coli DH5α为本室保存；pGEM-T Easy载体购自Promega公司。淋巴细胞分离液购自Sigma公司；限制性内切酶BglⅡ、HindⅢ和基因组DNA提取试剂盒均为大连宝生物产品；2×PCR Master Mix试剂盒购自上海晶美生物技术有限公司；小量质粒抽提试剂盒购自宁波中鼎生物技术公司；200 bp Marker及DNA凝胶回收试剂盒为上海生物工程技术有限公司产品。 1.2 模板DNA制备 弓形虫RH株速殖子连续在小鼠体内传代，感染3 d后无菌操作抽取腹水，虫体用生理盐水洗涤3次，加入与虫体混悬液等量的淋巴细胞分离液，800 r/min离心8 min后加速至2 000 r/min离心10 min，收集中层虫体[7]，按DNA提取试剂盒说明书抽提弓形虫基因组DNA，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。 1.3 PCR扩增 根据弓形虫NTPase参考核苷酸序列[8]和表达载体克隆位点内切酶图谱分析结果，采用Primer Designer引物设计软件自行设计引物，由上海基康生物技术公司合成，引物序列如下：上游引物：5’-GAAGATCTACAGACTCATCGTCACT CCG-3’（下划线为BglⅡ酶切位点），下游引物：5’-GCAAGC