当归注射液预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌组织中Survivin.doc

当归注射液预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌组织中Survivin 　【摘要】 目的：观察当归注射液对缺血再灌注损伤心肌细胞内Survivin表达的变化，探讨当归抗心肌缺血再灌注损伤保护作用的机理。方法:将35只SD大鼠随机分成4组:正常对照组(n=5)，假手术组(n=10)，缺血再灌注组(n=10)，当归治疗组(n=10) ,建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做免疫组织化学染色；观察各组动物心肌细胞内Survivin表达的变化。利用HPIAS-2000图像分析系统测定Survivin在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组心肌细胞内Survivin表达低呈阴性；当归治疗组心肌细胞内Survivin表达较低呈阴性。假手术组心肌细胞内Survivin表达也较低呈弱阳性，缺血再灌注损伤组Survivin表达较高呈阳性。图像分析结果显示：正常对照组、当归治疗组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间Survivin表达的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(Plt;0.01)；正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间Survivin表达的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(Pgt;0 05)。结论：当归注射液对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞有重要的保护作用。 【关键词】 当归注射液； 缺血再灌注； 心肌； Survivin 当归含有阿魏酸、多种磷脂、人体必需氨基酸和微量元素等。目前已证明,当归对心血管系统、血液造血系统、免疫系统、抗氧化和清除自由基等多方面均有肯定的药理作用［1］。目前在研究药物治疗心肌缺血方面还没有任何一种能绝对减少心肌梗死,对抗心肌缺血。当归是活血养血的传统中药,具有清除氧自由基、降低胆固醇、抗血栓形成等作用,临床用于治疗高血压病、缺血性心脏病。目前在研究药物治疗心肌缺血方面还没有任何一种能绝对减少心肌梗死,对抗心肌缺血［2］。当归是活血养血的传统中药,具有清除氧自由基、降低胆固醇、抗血栓形成等作用,临床用于治疗高血压病、缺血性心脏病［3］。本实验观察当归注射液对缺血/ 再灌注过程心肌的保护作用,研究当归注射液抗心肌缺血/ 再灌注损伤的作用机理。旨在指导临床合理应用当归治疗心血管疾病,开辟当归在体外循环手术前和术中应用的新途径。 Survivin是近年发现的细胞凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的一个新成员，它主要表达于发育中的胚胎组织以及人类常见的恶性肿瘤组织，而在人类分化成熟组织中不表达（胸腺除外）［4］。Survivin蛋白表达的特异性［5］，有望成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。以往的研究表明： Survivin与肿瘤细胞增殖、凋亡、血管生成有关，但是Survivin在心肌缺血/ 再灌注损伤中的抗凋亡机制未见报道。本实验采用免疫组织化学方法观察当归注射液对缺血/再灌注过程心肌的保护作用,研究当归注射液抗心肌缺血/再灌注损伤的作用机理。旨在指导临床合理应用当归治疗心血管疾病,开辟当归在体外循环手术前和术中应用的新途径。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物模型制备及分组 选用健康雄性Wistar大鼠（SPF级）35只,体重250～300g左右。腹腔注射戊巴比妥钠4.5 mg·(100g)-1,麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸［ 呼吸频率60 次·min-1 ,潮气量2ml·(100g)-1］,沿胸骨左缘第4肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/ 开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成4组: 正常对照组（不做任何处理）；假手术组（丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎）；缺血再灌注损伤组(IR)（ 缺血/ 再灌注前静脉注射生理盐水0.8ml / kg，结扎左冠状动脉前降支45min ,再灌注120 min ）；当归注射液预处理组（在结扎前20min，静脉注射当归注射液0.8ml/ kg , 其它处理同缺血/ 再灌注组）。 1.2 主要试剂 25%当归注射液为武汉大学中南医院制药厂提供；即用型兔抗鼠Survivin单克隆抗体，即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸，以上试剂均购于北京中杉生物技术有限公司。 1.3 方法 1.3.1 常规HE染色 取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色。 1.3.2 免疫组织化学S-P法检测Survivin相关抗原 主要步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，Survivin均采用高压抗原修复，正常羊血清处理10 min以减少非特异性背景，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理10 min，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物处理1