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沉香随机扩增多态性DNA反应体系建立 　 作者：邵敏 周鹤峰 唐历波 刘银花 李官成 【摘要】 　　目的对影响沉香随机扩增多态性DNA（RAPD）反应的各因素进行优化，建立适用于沉香RAPD的最佳反应体系。方法采用改良的CTAB法提取基因组DNA，变化单一因素的方法对模板 DNA浓度、Taq酶用量、dNTPs、引物浓度、Mg2+浓度、退火温度对RAPD影响进行分析。结果建立了适合沉香RAPD分析的最佳反应体系：在20μl反应体系中，模板DNA用量20 ng、Taq酶1.0 U、dNTPs浓度为0.3～0.4 mmol·L-1、随机引物浓度为0.6 μmol·L-1、Mg2+浓度1.5～2.0 mmol·L-1。PCR反应条件：94℃，10 min；94℃，1 min；36℃，1 min；72℃，2 min；45个循环，72℃，8 min。结论该反应体系具有良好的稳定性和重复性。 【关键词】 沉香； RAPD； 基因组DNA； 反应体系 　　Abstract：ObjectiveTo establish the optimum RAPD reaction system of Aquilaria agallocha Roxb.MethodsThe genomic DNA was extracted from Aquilaria agallocha Roxb. by modified CTAB method,and the different Template DNA,Taq,dNTPs,Primer,Mg2+，the annealing temperature were analyzed. ResultsThe optimized reaction system and program of RAPD for Aquilaria agallocha Roxb. were as follows:The reactions were performed in a volume of 20μl，which containing 20ng DNA,1U Taq ploymerase, 0.3～0.4 mmol·L-1 dNTPs,0.6 μmol·L-1 random Primer,1.5～2.0 mmol·L-1 Mg2+.After pre-denaturing at 94℃ for 10 min,under the condition of denaturing at 94℃ for 1 min,annealing at 36℃ for 1 min,extension at 72℃ for 2 min,amplifying for 45 cycles,finally extension at 72℃ for 8 min. ConclusionThe reaction system is reproducible and highly stable. 　　Key words：Aquilaria agallocha Roxb.; RAPD; Genomic DNA; Reaction system 　　沉香为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis (Lour.)Gilg含有树脂的木材［1］，是一种热带亚热带常绿乔木。白木香是我国生产沉香药材唯一的植物资源，主要分布于广东省东南部、西南部、中部以南地区和海南，属国家二级保护野生植物。沉香是临床常用的理气药，具行气止痛、温中止嗳、纳气平喘功效，用于治疗胸腹胀痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等症。据统计，建国至今有一千六百多个药方使用沉香；另外，沉香树是很好的园林绿化树种，又是珍贵的天然香料。长期以来由于森林资源、生态环境遭受灾害和人为破坏，天然沉香资源日趋枯竭。在现有的文献资料中，对白木香的研究主要集中在组织培养和化学成分等方面，遗传学方面的研究尚未见报道。 　　随机扩增多态性DNA技术(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)是1990年由Williams等［2］在聚合酶链式反应(PCR)基础上建立的新的检测基因组多态性的基因分型技术，被广泛运用于分类学、物种亲缘关系、动植物品系鉴定、特定性状分子标记以及基因定位、遗传图谱构建等各个方面。运用RAPD技术对沉香进行遗传多样性的研究过程中，需要建立标准化、稳定的反应体系。 　　本实验对影响RAPD反应的主要因素，如模板DNA的浓度、引物浓度、镁离子浓度、Taq酶用量等进行研究，以期建立沉香RAPD最佳反应体系，为进一步应用RAPD技术对沉香遗传稳定性的研究奠定基础。 　　1 器材与方法 　　1.1 材料沉香购于海南屯昌英扬沉香开发有限公司，经遵义医学院唐历波副教授鉴定为瑞香科植物