熊果酸对A549细胞增殖、凋亡影响及其机制.docVIP

熊果酸对A549细胞增殖、凋亡影响及其机制 　【摘要】 目的 探讨三萜酸类化合物熊果酸(Ursolic Acid,UA)对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法 利用噻唑蓝(MTT)比色法观察UA对A549细胞增殖的影响。流式细胞仪检测UA对细胞周期的影响。用Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞核形态变化。利用免疫印迹法(Westernblot法)检测细胞中活化型Caspase3蛋白及NFκB表达的变化。结果 UA明显抑制A549细胞的生长(Plt;0.05)，并呈时间和浓度依赖。流式细胞仪检测发现UA作用24和48h后A549细胞阻滞在G0/G1期(P均lt;0.05)。经UA处理后的实验组细胞呈现典型的凋亡核固缩表现，胞核呈致密浓染的颗粒状或块状荧光。胞质检测到活性Caspase3蛋白的表达增强，并呈时间依赖，同时，NFκB表达随时间延长而减弱。结论 熊果酸在体外对A549细胞具有抗增殖和诱导凋亡的作用。核因子NFκB参与肺癌细胞的增殖与凋亡调控, UA可通过抑制NFκB活性，激活Caspase3，从而诱导细胞的凋亡。 【关键词】 熊果酸 凋亡 细胞增殖 NFκB Caspase3 0 引 言 熊果酸(Ursolic Acid,UA)属于三萜酸类化合物，近年来研究表明，其对多种肿瘤具有广泛的抑制杀伤作用［14］。UA抗肺腺癌细胞的研究罕见报道，本研究主要探讨UA对人肺癌细胞A549抑制生长和诱导调亡的作用及机制。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 人肺癌细胞系 A549为本系自行传代培养，RPMI1640、PI染料、MTT、RNA酶、Hoechst33258及UA均购自Sigma公司；兔抗人Caspase3多克隆抗体、NFκB单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司；二甲基亚砜、噻唑蓝为Amresco公司进口分装。 1.1.2 主要仪器设备 流式细胞仪为Beckman公司产品，倒置光学显微镜为Olympus公司产品，荧光显微镜为Leica公司产品，半干转印仪为Biorad公司产品。 1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养 A549细胞用含10%小牛血清的RPMI1640培养液，37℃、5%CO2的培养箱中培养。取指数生长期细胞用于实验。 1.2.2 增殖抑制实验 将A549细胞浓度调节至1.0×105/L,加200μl于96孔板中，24h后换液，设空白调零组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂)及实验组(加不同浓度的干预药物),每组设6个复孔，培养一定时间后加入MTT (5g/L)20μl，继续培养4h后吸出上清，每孔加DMSO150μl，振荡溶解10min，待结晶完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长570nm处，空白孔调零，测定各孔吸光度A值。计算增殖抑制率=[(对照组吸光度值－处理组吸光度值)/对照组吸光度值]×100％。用直线回归方程求得UA作用48h后的半数抑制浓度（IC50），此浓度为以下实验的干预浓度。 1.2.3 细胞周期检测 取对数生长期的A549细胞2×105/ml接种于培养瓶中，培养至密度达60%～70%。实验设对照组（不加药物），UA（IC50）均重复3瓶。培养24h、 48h后常规收集细胞，PBS洗3次后，70%冷乙醇4℃固定过夜。检测前PBS洗两次,10μg/ml的RNA酶37℃消化0.5h,100μg/ml的PI避光染色30min,置流式细胞仪检测。 1.2.4 Hoechst33258荧光染色 将A549细胞以1×105/ml浓度接种于6孔培养板，每孔2ml，37℃，5%CO2培养24h后加入UA（IC50），使它的继续培养48h，弃去培养基后，用固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶1）固定20min。PBS漂洗2次后，加入10μg/ml的Hoechst33258， 37℃避光染色10min。荧光显微镜下观察细胞核形态。 1.2.5 Western blot 取对照组和UA（IC50）作用24h、48h后细胞各4×106个，裂解后加等体积的上样液混匀, 煮沸3 min后进行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳，用半干转膜仪将蛋白转移至PVDF膜上,5％脱脂奶粉封闭。分别以Caspase3、NFκB抗体进行免疫印迹杂交(兔抗人Caspase3多克隆抗体浓度1∶100和鼠抗人NFκB单克隆抗体浓度1∶1000) 4℃下孵育过夜, 洗膜后加入辣根过氧化物酶标记二抗 (1∶1000 稀释)，37℃孵育1h，ECL显色，压片。 1.3 统计学处理 用SPSS11.5软件进行单因素方差分析，半数抑制浓度（IC50）用直线相关与回归法计算。 2 结果 2.1 增殖抑制实验 20～60μmol