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痔疮组织中血管内皮生长因子表达及意义 　 作者：徐跃军　张端莲　吴惠芬 蔡丽华 【摘要】 目的:观察血管内皮生长因子在痔疮组织中的表达及临床意义。方法:收集武汉市第八医院肛肠科手术切取的痔疮组织40例，另取痔疮组织周围正常组织5例作对照。应用免疫组织化学方法检测痔疮组织及周围正常组织中血管内皮生长因子的表达，利用HPIAS-2000图像分析系统测定血管内皮生长因子在以上两组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果:痔疮组血管内皮细胞内血管内皮生长因子呈阳性表达，正常对照组血管内皮细胞内血管内皮生长因子呈阴性表达。 免疫组织化学结果表明痔疮组血管内皮细胞内血管内皮生长因子表达明显高于正常组织血管内皮细胞，有显著性差异（ P lt;0.01 ）。图像分析结果显示，痔疮组与正常对照组之间血管内皮生长因子平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义（ Plt;0.01）。结论:血管内皮生长因子在痔疮的形成过程中起了重要的作用。 【关键词】 痔疮; 血管内皮生长因子; 免疫组化 　　痔是人类常见的一种疾病。痔被认为是直肠下端或肛管存在丰富的静脉丛，如果在一处或数处发生扩张或曲张，即成为痔，亦即痔是突出的静脉团，是各种原因造成的血管病变，但确切机制还不清楚。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）又称血管通透性因子，是目前所知作用最强的一种促血管生长因子，是新生血管形成的中心调控因子和血管内皮细胞特异的有丝分裂原。血管内皮生长因子的过量表达对血管内皮细胞的异常增殖及小血管的过度形成起重要作用。本课题应用免疫组织化学的方法研究了VEGF与痔形成的关系，旨在进一步探讨痔疮形成的确切机制。 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　1.1.1材料来源 收集武汉市第八医院肛肠科手术切取的痔疮组织40例，另取痔疮组织周围正常组织5例作对照。其中男性25例，女性15例。患者术前均未做任何辅助性治疗。 　　1.1.2材料分组 蜡块切片厚5μm，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。常规HE染色和免疫组织化学S-P法检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）。 　　2材料和方法 　　2.1主要试剂和仪器 　　2.1.1主要试剂 即用型鼠抗人VEGF单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）;超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）;DAB显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。 　　2.2主要仪器YWY781型医用微波仪（250W，50Hz），浙江临安电子器材厂生产;家用高压锅。 　　2.3方法 　　2.3.1常规HE染色 取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。 　　2.3.2免疫组织化学S-P法检测VEGF相关抗原主要步骤:①组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗;② 3%过氧化氢，37℃孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min;③ VEGF采用微波抗原修复（3档，10min），PBS洗4×5min;④ 正常羊血清37℃孵育10min以减少非特异性反应;⑤ 一抗VEGF37℃孵育1 h，PBS洗4×5min;⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;⑦ 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应;⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。 　　2.4免疫组织化学结果判断 VEGF相关抗原以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。 采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对VEGF表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下VEGF阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100% 　　2.5统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK- q检验，检验水准α 为 0.05。 　　3结果 　　3.1HE染色正常对照组可见肛管黏膜下为海绵状的血管组织，并有丰富的动、静脉吻合管，又称为直肠海绵体，是由血管、平滑肌、弹力纤维和结缔组织所构成的，其血管和结缔组织结构正常。痔疮组可见病变区血管扩张，血液淤滞，组织水肿，血凝块形成，以及纤维断裂。有部分严重病例可见局部组织坏死、糜烂出血。 　　　3.2VEGF的表达痔疮组血管内皮细胞胞浆内可见较多