白桃汤剂抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤生长及其血管生成实验探究.docVIP

白桃汤剂抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤生长及其血管生成实验探究 　 作者：欧阳瑾，曹志友，王爽，雷钧涛 【摘要】 　　目的观察白桃汤剂对C57BL/6小鼠体内Lewis肺癌生长、血管生成及转移的影响。方法复制C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型，随机分为4组，分别给予生理盐水，白桃汤低剂量，高剂量，环磷酰胺(CTX)治疗，观察肿瘤生长，运用免疫组化方法对移植瘤中血管内皮细胞生长因子(VEGF)和微血管密度(MVD)的表达及转移发生率等指标进行检测和分析。结果白桃汤剂低、高剂量组VEGF的表达率分别为54.6%、48.7%；MVD分别（27.26±3.39），（22.85±3.23）；瘤重分别为（2.66±0.46）g,(2.22±0.36) g；抑瘤率分别为35.4%,46.2%。生理盐水组VEGF的表达率为79.5%，MVD为（46.18±5.21），经统计学处理有显著性差异(Plt;0.05)，VEGF高表达率与MVD的关系经直线相关分析，呈显著正相关。结论白桃汤剂可以降低移植瘤MVD与VEGF的高表达率，VEGF表达率与MVD呈正相关。白桃汤剂对鼠Lewis肺癌的血管生成、生长和转移有明显的抑制作用。 【关键词】 白桃汤剂； 肺肿瘤； 血管内皮生长因子； 微血管密度； 小鼠 　　白桃汤剂为民间祖传秘方，曾为不少病人解除过病痛。目前研究中药抗肿瘤治疗已成为热点之一，本实验观察白桃汤剂治疗对Lewis肺癌小鼠血管密度(MVD)及血管内皮细胞生长子(VEGF)的影响，从肿瘤血管生成的角度探讨白桃汤剂的抑瘤效应及其机制，旨在为该药在临床上的进一步应用提供科学依据。 　　1 材料 　　Lewis肿瘤细胞株(购于中科院上海细胞库)。健康C57BL/6纯系小鼠雌雄各半，体质量(19±2)g（购于吉林省长春市生物制品研究所）。白桃汤剂方由核桃皮15 g，白附子15 g，甘草10 g，黄芪20 g等组成（吉林医药学院自制），按常规方法制成1 g/ml保存备用。第VⅢ因子(F8)单克降抗体，血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体及SP免疫组化试剂盒（均购于福州迈新生物技术开发公司）。环磷酰胺(CTX)0.2 g/支（上海华联公司产品，批号:01014）。 　　2 方法 　　2.1 接种液准备将小鼠Lewis肺癌细胞置于含10%胎牛血清及DMEM的完全培养液中，在37℃，5%CO2培养箱中培养，2～3 d更换1次培养液，0.25%胰蛋白酶消化传代。细胞总数达到要求后，台盼蓝拒染法测定活细胞数＞95%，调节细胞浓度为5×106 ml-1的细胞悬液备用。 　　2.2 造模取40只小鼠，雌雄各半，体质量（18±1）g，于腋后线第6肋间胸腔接种，每只接种0.2 ml，细胞计数为5×106 个细胞/ml。建立小鼠肿瘤动物模型。 　　2.3 分组造模2d后随机分成4组，每组10只。生理盐水组(A组)：给予生理盐水0.2ml灌胃，1次/d；白桃汤剂低剂量组(B组)：0.2ml药液灌胃（相当于40 ㎎/㎏），1次/d；白桃汤剂高剂量组(C组)：0.6ml药液灌胃（相当于120 ㎎/㎏），1次/d；环磷酰胺(CTX)组(D组),用量（60 ㎎/㎏）腹腔注射，1次/d，同时以生理盐水0.2 ml灌胃。各组均连续给药15d。第17天处死全部小鼠进行指标检测。 　　2.4 观察项目 　　2.4.1 瘤体积、瘤重用游标卡尺测量瘤体长径和短径，计算瘤体积，瘤体积=0.5ab2 (a-长径,b-短径)绘制增殖曲线。肿瘤抑制率=(生理盐水组平均瘤重-给药组平均瘤重)/生理盐水组平均瘤重×100%。 　　2.4.2 肿瘤组织微血管密度(MVD)检测完整剥离肿瘤组织，10％甲醛固定，24 h后石蜡包埋，切成厚4 μm的切片，常规方法脱蜡脱水，PBS漂洗，兔抗鼠VⅢ因子单克隆抗体(丹麦DAKO公司)4℃孵育过夜，PBS漂洗后加二抗，室温30 min，PBS漂洗后DAB显色，苏木精衬染。按试剂盒操作说明进行免疫组织化学染色，肿瘤区域内任何呈棕黄色染色的单个或多个内皮细胞、与周围肿瘤细胞及间质细胞有明确分界者计数为1个微血管，先于低倍镜(100×)下确定切片中肿瘤血管最密集、染色最强的区域，在此区域内显微镜下记数20个视野肿瘤微血管数目，以平均每高倍镜(200×)视野微血管个数表示MVD［1］。 　　2.4.3 血管内皮细胞生长因子(VEGF)免疫组化染色及阳性表达结果的判定VEGF免疫组化染色采用SP法。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知VEGF阳性的乳腺癌作为阳性对照。阳性表达结果判定采用半定量记分法，即每张组织切片染色强度：阴性0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，深棕黄色为3分。阳性细胞比例：O％ 为0分；≤25％为1分，26％～50％为2分；gt;50％为3分。两项打分