真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexin A2构建及其在293T细胞中.docVIP

真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexin A2构建及其在293T细胞中 　 作者：李娜, 周红 俞颖, 王婷 黄宏亮, 石文霞 王海波 【摘要】 目的： 构建含有人Annexin A2基因的真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexin A2，并在真核细胞293T中表达。 方法： 将质粒pCMV5Annexin A2上Annexin A2基因酶切后与真核表达质粒pIRES2eGFP连接，酶切鉴定及测序正确后，脂质体介导法转染293T细胞，荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测其基因和蛋白的表达。 结果： 构建的质粒pIRES2eGFPAnnexin A2转染293T细胞后，目的基因mRNA和蛋白表达均明显增高。 结论： 成功构建pIRES2eGFPAnnexin A2质粒并表达蛋白，为研究Annexin A2的生物学功能奠定了基础。 【关键词】 Annexin A2； 真核表达； 抗磷脂综合征 ［Abstract］ Objective: To construct pIRES2eGFPAnnexin A2 eukaryotic expression vector carrying human Annexin A2 gene and express Annexin A2 protein in 293T cell.Methods： Annexin A2 gene digested from pCMV5Annexin A2 was ligated into eukaryotic expression vector pIRES2eGFP.After restriction analysis and sequencing, the recombinant plasmid pIRES2eGFPAnnexin A2 was transfected into 293T cells in the mediation of liposome.The expression of Annexin A2 was analyzed by western blot and realtime PCR. Results： The expression of Annexin A2 at both mRNA and protein levels were significantly increased when transfected with pIRES2eGFPAnnexin A2 in 293T cells. Conclusion： The eukaryotic expression vector pIRES2eGFPAnnexin A2 was correctly constructed and the Annexin A2 protein was successfully expressed in 293T cells.This will facilitate the following study on Annexin A2. ［Key words］ Annexin A2; eukaryotic expression； antiphospholipid syndrome Annexins是一类钙依赖的膜磷脂结合蛋白，脊椎动物细胞的Annexins被命名为Annexin A 家族。其中Annexin A2由339个氨基酸组成，分子量36 kDa，主要表达于人单核细胞、内皮细胞和一些肿瘤细胞中，在细胞的膜形成、膜聚合、胞吞和胞吐中发挥功能。细胞膜上Annexin A2可作为多种蛋白的受体，在感染发生、肿瘤迁移、血凝和纤溶过程中起着重要作用。研究表明，它可作为纤溶酶原及组织纤溶酶原激活物的共同受体，介导纤溶酶的生成，有利于纤维蛋白的降解，维持纤溶的内稳态［1-3］。最近的研究发现，Annexin A2异源四聚体可介导纤溶酶与单核细胞结合，传递下游信号，引起趋化作用和炎性介质释放，与慢性炎症的发生发展有关［4］。 本小组的研究提示［5］，Annexin A2在抗磷脂抗体引发的血栓形成中起着重要作用，它可能作为抗磷脂抗体与磷脂结合蛋白复合物的受体，介导下游信号，引起血栓形成。本实验旨在构建真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexin A2，并在293T细胞中表达目的蛋白，为进一步研究Annexin A2在抗磷脂综合征中的作用奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材 料 DMEM及optiMEM培养基购于美国Gibco公司。胎牛血清购于兰州民海生物工程有限公司。逆转录试剂盒购于日本Toyobo公司。rTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内