硒化壳聚糖诱导人早幼粒白血病细胞凋亡探究.doc

硒化壳聚糖诱导人早幼粒白血病细胞凋亡探究 　 作者：邓守恒，曹凤军，蔡晓军，王贤和，陈萍 【摘要】 　　目的探讨硒化壳聚糖对人早幼粒白血病细胞增殖及凋亡的影响。方法应用SRB法和集落形成法检测硒化壳聚糖对人早幼粒白血病细胞增殖的抑制作用；应用流式细胞法检测药物对细胞的促凋亡作用；应用Western blot法检测WTI蛋白表达的情况。结果25，50，100 mg/L硒化壳聚糖作用HL60细胞48h对细胞有增殖抑制作用（Plt;0.01）；50，100 mg/L硒化壳聚糖作用细胞48 h后，G0/G1期细胞数较对照组增加了14.9%和22.0%（Plt;0.05），S期细胞减少了14.3%和20.1%（Plt;0.05），凋亡率分别是（6.7±1.6）和（11.8±2.1）；50，100 mg/L硒化壳聚糖作用HL60细胞48 h后WTI蛋白表达分别下调38.2%（Plt;0.05）和64.3%（Plt;0.01）。结论硒化壳聚糖具有对人早幼粒白血病细胞增殖抑制及促凋亡作用，WTI在此过程中可能发挥着重要的作用。 【关键词】 硒化壳聚糖； 早幼粒白血病； 凋亡 壳聚糖［β(1,4)-2-氨基-2-去氧-D-葡萄糖］是存在于自然界中的一种碱性生物多糖，在酸性条件下带正电，与肿瘤细胞表面的阴离子可以通过吸附放电进行中和，抵制其生长，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等多种生物活性［1］，且生物相容性良好，几乎无毒性，没有其它不良反应，在现代药物制备中经常作为良好的药物材料进行开发，拓展其应用范围, 硒化壳聚糖［2］是将壳聚糖与亚硒酸在酸性条件下，以混合金属离子为催化剂，通过拼合原理制备而成的一种有机硒，可有效克服无机硒不易被细胞吸收，活性和毒性范围较窄，致死量相对较小等缺点［3］。目前正对其抗肿瘤作用进行研究。硒和砷属同族，而三氧化二砷在临床上早已做为一种抗早幼粒白血病药物使用，故硒化壳聚糖也应具有抗早幼粒白血病的作用，且毒副作用应该比无机硒和砷小得多。本实验以人早幼粒白血病细胞株HL60为靶细胞，观察了硒化壳聚糖对其产生的诱导凋亡作用并探讨了可能的作用机理，为硒化壳聚糖用于治疗人早幼粒白血病奠定基础。 　　1 材料与仪器 　　1.1 试药试剂硒化壳聚糖（批号：100601-200518）由本院自制，含硒量为0.4%；Western blot试剂盒为Promega产品；WTI抗体为Santa Cruz产品；甲基纤维素（CPS4000）、磺酰罗丹明B（SRB）、碘化丙锭(ＰＩ)为sigma产品。 　　1.2 仪器倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）；Mod 550型全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）；Epics Elite ESP型流式细胞仪（美国Coulter公司）。 　　1.3 细胞人早幼粒白血病细胞株HL60引自福建省血液病研究所。 　　2 方法 　　2.1 细胞培养HL60细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素和2 U/ml谷氨酰胺的RPMI 1640培养基内，于37℃，饱和湿度，5%CO2条件下培养, 细胞接种24 h后即处于指数生长期。 　　2.2 SRB法测定硒化壳聚糖对细胞的抑制作用［4］收集对数生长期细胞以全培养液稀释成5×104个/ml单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每个浓度复种4孔，每孔180 μl，每孔加入不同浓度硒化壳聚糖20 μl，对照组加入同量培养液，置37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中孵育48h后，每孔小心加入预冷的80%醋酸50 μl，静置5 min后再将平板移至4℃放置1 h，倒掉固定液，用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥，每孔加入100 μl SRB液，室温放置10 min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥，结合的SRB用150 μl 10 mmol/L非缓冲Tris碱液（pH10.5）溶解，酶标仪检测550 nm波长光密度并计算抑制率，实验重复3次。 　　2.3 HL60细胞克隆形成实验［4］参照文献配制半固体培养基，HL60细胞经不同浓度硒化壳聚糖作用48 h后， PBS洗去药物，离心1 000 r/min×3 min，用含20%小牛血清的RPMI-1640完全培养液稀释为7.0×103个/ml单细胞悬液,于24孔塑料培养板预加1.2%甲基纤维素培养基1.0 ml/孔，加入单细胞悬液50 μl，使每孔细胞数为350个,每个浓度设4个复孔。混匀后置37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中孵育10～12 d后于倒置显微镜下计数细胞克隆数，计算细胞存活率（给药组平均克隆数/对照组平均克隆数×100%）,实验重复3次。 　　2.4 流式法检测细胞凋亡及周期阻断作用HL60细胞经不同浓度硒化壳聚糖作用48 h后，收集细胞，加70%乙醇1 ml，-20