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神经源性膀胱M2受体mRNA变化 　【摘要】 目的 研究犬脊髓损伤后致神经源性膀胱逼尿肌中毒蕈碱样胆碱受体亚型(M2)受体的变化,探讨M2受体在犬神经源性膀胱逼尿肌的意义。方法建立动物模型,设骶上型、骶下型神经源性膀胱组和对照组,RTPCR法半定量检测膀胱体部逼尿肌M2受体mRNA。结果骶上型组膀胱容量(281.0±26.2)mL,逼尿肌压力(58.5±5.7)cmH2O,膀胱顺应性(4.8±1.1)mL/cmH2O;骶下型组容量(513.2±44.4)mL,逼尿肌压力(40.3±4.1)cmH2O,顺应性(12.2±2.1)mL/cmH2O,2组比较有统计学意义(Plt;0.05)。对照组逼尿肌压力(43.0±3.9)与骶下组比较无统计学意义。对照组膀胱逼尿肌有M2受体mRNA表达,骶上型组和骶下型组M2受体mRNA较对照组增加(Plt;0.05),骶上型组明显高于骶下型组(Plt;0.05)。结论脊髓损伤后神经源性膀胱逼尿肌M2受体增多,骶上型M2受体增多更明显,M2受体可能直接参与骶上型神经源性膀胱逼尿肌无抑制性收缩。 【关键词】 膀胱 神经源性 受体 毒蕈碱 疾病模型 动物 RNA 信使 神经源性膀胱是临床常见疾病,临床处理棘手。笔者建立犬神经源性膀胱的骶上和骶下型动物模型,运用RTPCR方法半定量检测正常犬和模型犬膀胱逼尿肌中的M2受体mRNA,探讨其变化与意义。 1材料和方法 1.1材料 1.1.1动物家养杂交雌性犬15只,由中山大学北校区动物实验中心提供并饲养(实验动物许可证号为Scxk粤20030001),体质量(13.5±1.5)kg,随机分为对照组、骶上组和骶下组,各5只。3组间体质量具有可比性。 1.1.2仪器尿动力仪(Ⅳ型,美国LifeTech公司);数字减影血管造影机(1000 MAX型,日本Toshiba公司);PCR扩增仪(PE9600型,美国Perkin Emer公司);凝胶成像扫描仪(Gel Doc 2000型,美国BioRad公司)。 1.1.3引物 M2受体和内参GAPDH引物用Primer软件设计,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。序列如下: M2受体: 上游:5’AAG TCA ACC GTC ACC TCC3’ 下游:5’ATC CTC CAC AGT CCT CAC3’ 内参GAPDH: 上游:5’GAT GCT GGT GCT GAG TAT GT3’ 下游:5’CTT CTG GGT GGC AGT GAT3’ 1.1.4试剂Trizol试剂[宝生物工程(大连)有限公司]。第一链cDNA合成试剂盒(立陶宛Fermentas公司),内含5×Reaction Buffer;dNTP Mix(10 mmol/L);Oligo(dT)18Primer(0.5 μg/μL);Random Hemamer Primer(0.2 μg/μL); ControlPrime(10 pmol/μL);ControlRNA(0.5 μg/μL); DEPCtreatedWater;MMuLVReverseTranscriptase(200 U/μL);RibonucleaseInhibitor(20 U/μL)。Marker(上海生工生物工程技术服务有限公司)。琼脂糖,焦碳酸二乙酯(DEPC)(美国Sigma公司)。其他试剂均为国产分析纯试剂。 1.2方法 1.2.1神经源性膀胱动物造模根据文献[1]并加以改进。动物麻醉后,沿L4~6 棘突间作纵形切口,暴露L4~6 棘突,咬除L5棘突及椎骨,暴露脊髓。骶上型以剪刀完全锐性横断L4~5椎间隙水平脊髓;骶下型在横断脊髓后用探针向下完全钝性破坏横断面以下脊髓,并充填无菌明胶海绵。对照组未行手术。 1.2.2膀胱尿道造影及尿动力学检测造模3个月后行膀胱尿道造影及尿动力学检测。犬麻醉,仰卧位,膀胱置入8F红色尿管,注入76%复方泛影葡胺溶液,在数字减影机器监视下摄片完成造影。以卵圆钳撑开阴户口,暴露尿道外口。7F膀胱测压管经尿道置入膀胱,注射器抽空膀胱尿液。9F直肠测压管置入直肠,充盈气囊。零点压力定为大气压下耻骨联合水平。排除导管内气体,仪器调零。采用微量输液泵经7F膀胱测压管的顶孔向膀胱内匀速(40 mL/min)灌注生理盐水,侧孔连接压力换能器, A:正常; B:骶上型(膀胱容量减少); C:骶下型(膀胱容量增大). 以尿道外口出现尿液作为排尿开始的标志,计算机自动测量膀胱容量、逼尿肌压力(膀胱压力直肠压力)及膀胱顺应性(膀胱容量增加值/逼尿肌压力增加值)。 　 1.2.3标本采集和处理完成上述步骤后,氯胺酮肌肉注射,行下腹正中切口,暴露膀胱,每组每只犬切取膀胱体部约1 cm×