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稳定表达核仁素H9C2细胞株建立及鉴定 　 作者：宋娟 张任飞 张彬 蒋碧 【摘要】 目的：建立稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞株,为进一步研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作用提供细胞模型。方法：将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染技术导入H9C2细胞，使核仁素在细胞内表达，用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株；用双酶切、DNA测序鉴定质粒，用RT-PCR及Western blot检测核仁素基因在靶细胞中的整合与表达。结果：经G418反复筛选的H9C2细胞株中，核仁素基因在mRNA及蛋白质水平表达均较野生型细胞及转空载体细胞升高。结论：用含核仁素全长的质粒转染H9C2大鼠心肌细胞，经筛选后可稳定表达核仁素。 【关键词】 核仁素；H9C2细胞；基因转染 Abstract Objective:To establish H9C2 cell line that can stably express the nucleolin,which can provide a cell line with which we can analyze the function of nucleolin in apoptosis of cardiomyocytes.Methods:The pCMV-Tag2B-Nuc plasmid was transfected into H9C2 cells with lipofectin,the stable transfectants screened by G418 and the expression of nucleolin was identified and analyzed by RT-PCR and Western blot.The pCMV-Tag2B-Nuc plasmid was confirmed by double-enzyme digestion and sequencing.Results:After G418 screening, compared with the control group,the mRNA and protein of nucleolin in transfected cell line were highly expressed, as demonstrated by the RT-PCR and Western blot analysis.Conclusion:The rat H9C2 cell line stably expressing nucleolin was successfully constructed. Key words Nucleolin; H9C2 cell line; Gene transfection 近年来的研究表明，越来越多的心血管疾病发生发展与细胞增殖和凋亡有关。细胞凋亡的发生机制十分复杂，至今仍未完全阐明。核仁素（又称C23）是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质，具有多种生物学功能，它不但直接参与核糖体的生物合成与成熟，还直接或间接参与细胞增殖、生长、胚胎发生、胞质分裂、染色质复制与核仁的发生等过程［１］。另有研究表明，核仁素蛋白的断裂和转位改变与细胞凋亡的发生相关［２，3］。因此，本研究拟建立能够稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞，为研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作用提供理想的细胞模型。 1 材料与方法 1.1 材料 质粒pCMV-Tag2B-Nuc由德国Hamburg-Eppe大学细胞生物化学与临床神经生物学研究所Stefan Kindler教授惠赠；H9C2细胞株由中南大学细胞中心提供；DMEM培养基，Gibco公司产；辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠或羊抗兔或羊抗小鼠IgG，Sigma公司产；无支原体胎牛血清，杭州四季清生物工程公司产；LipofectamineTM2000转染试剂盒，Invitrogen life technologies公司产。鼠抗C23单克隆抗体，Santa Cruz公司产；质粒抽提试剂盒，大连TaKaRa公司产；DAB显色试剂盒，武汉博士德生物技术公司产；Trizol试剂，Gibco BRL公司产。 1.2. H9C2细胞培养 大鼠心肌细胞株（H9C2）用含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞于37 ℃，5% CO2条件下培养，待细胞生长至约85%的融合状态用于实验。 1.3 质粒扩增、抽提及鉴定 质粒转化感受态细菌DH5α，挑取阳性克隆进行扩增；质粒抽提依试剂盒说明书进行；用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒，一部分1％琼脂糖胶电泳，拍照；另一部分送上海博亚生物技术有限公司测序。 1.4 脂质体转染 根据生命技术公司提供的转