紫外分光光度法测定鹰嘴豆及豆芽中异黄酮含量探究.docVIP

紫外分光光度法测定鹰嘴豆及豆芽中异黄酮含量探究 　 作者：程珍 阿依古力·阿不列孜 马庆玲 高艳华 阿吉艾克拜尔·艾萨 【摘要】 目的建立一种检测鹰嘴豆异黄酮含量的快速分析方法，并检测鹰嘴豆和豆芽中异黄酮的含量。方法采用紫外分光光度法，检测波长为260.9 nm，测定鹰嘴豆及其豆芽中异黄酮的含量测定。结果鹰嘴豆芽素A在2～30 μg/ml范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系，以黄酮总含量测定结果重复性RSD=1.95%，加样回收率为100.18%。结论为鹰嘴豆提取物及制品提供一种简单、可靠、有效的测定方法。 【关键词】 鹰嘴豆 豆芽 异黄酮 紫外分光光度 鹰嘴豆是豆科鹰嘴豆属鹰嘴豆Cicer afiefinum L．的成熟种子，为一年生栽培植物，维吾尔语称其为诺胡提(音译)，主要种植在新疆、甘肃等地区，是维吾尔族人常用的药食两用的食品，有治疗糖尿病、高脂血症、支气管炎、性欲降低等疾病的作用。 有关鹰嘴豆中异黄酮的报道不多，谭永霞等［1］从鹰嘴豆中分离得到异黄酮，关于鹰嘴豆异黄酮的含量测定及其方法均未见报道。本研究用自制的鹰嘴豆芽素A为标准品，在紫外最大吸收峰260.9 nm处测定了鹰嘴豆和其豆芽异黄酮含量，豆芽中异黄酮含量达到5.057%，并确定了鹰嘴豆异黄酮含量测定方法。 1 材料与仪器 鹰嘴豆为木垒县产的“Desi”品种，豆芽经常规发芽得到，鹰嘴豆豆芽素A对照品为本实验室分离制备；试剂均为分析纯。 SHIMADZU UV-2550型分光光度计；戴安P680高效液相色谱仪；UVD170u型紫外检测器；Chromeleon型色谱工作站；超声波清洗器（KQ-250B型）；电子天平（SEJ180-4型）。 2 方法 2.1 样品液的制备精确称取2.0 g鹰嘴豆粉和干燥后的鹰嘴豆豆芽粉(过25目筛)，每一样品平行作两份，溶于20 ml的甲醇中，采用超声波提取3次，功率为59 kHz，温度为25℃ ，提取时间为45 min，过滤，合并滤液，测定吸收值，每一样品测3次，取6个测定的吸收值均值为该样品的吸收值。 2.2 标准品的制备和标准溶液的配制 2.2.1 标准品的制备鹰嘴豆豆芽提取物经硅胶柱、SephadexLH20层析后得到化合物，再经制备HPLC进一步纯化，归一法其纯度为98.96%，经1H-NMR，13C-NMR结构鉴定：黄色针状结晶，mp 216～217℃(CH3OH)。 H-NMR(DMSO-d6)6： 8．35(1H，s，H-2)，7．49(2H，d，J=8．4 Hz，H-2 ，6 )，6．99(2H，d，J=8．7 Hz，H-3 ，5 )，6．41(1H，d，J=2．1 Hz，H-8)，6．24(1H，d，J=1．8 Hz，H-6)，3．78(3H，s，OCH3)；13C-NMR(DMSO-d6)6：154．4(C-2)，122．7(C-3)，179．9(C-4)，161．5(C-5)，98．7(C-6)，163．9(C-7)，93．6(C-8)，157．5(C-9)，104．3(C-10)，121．9(C-1 )，130．0(C-2 )，113．6(C-3 )，159．0(C-4 )，113．6(C-5 )，130．0(C-6 )，55．0(OCH3)。以上数据与文献［2］一致，故鉴定化合物为鹰嘴豆芽素A(biochanin A)。 HPLC制备色谱条件：ODS-A色谱柱（250 mm×20 mm，5 μm）；流动相MeOH-H2O（80∶20）；进样量 1 ml；流速7 ml/min；检测波长260 nm。色谱图见图1。 图1 标准品鹰嘴豆芽素A的HPLC图 2.2.2 标准溶液的配置精确称取已纯化的鹰嘴豆芽素A标准品5.0 mg，置于25 ml容量瓶中，以甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，浓度为200 μg/ml。 2.3 波长的选择分别取一定浓度的标准溶液和样品液，在波长为200～400 nm的紫外区范围进行扫描，测定参数为Abs，中速，采样间隔为1 nm，记录范围-1.638～4.000，根据紫外吸收光谱图确定其测定波长。 　 2.4 标准曲线的绘制精确吸取0.10，0.20，0.40，0.50，1.00，1.50 ml标准品溶液分别置于6个10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。以甲醇作空白对照，在波长最大吸收峰处测定吸光度，得到以鹰嘴豆芽素A溶液浓度C为横坐标、吸光度值A为纵坐标的标准曲线，用最小二乘法进行线性回归，可得标准曲线方程。 3 结果 3.1 检测波长的确定鹰嘴豆异黄酮结构中羟基和芳环形成较强的共轭体系，对紫外光有较强的特征吸收，故选择紫外区进行波谱扫描。鹰嘴豆芽素A标准溶液的最大吸收波长在260.9 nm处，样品液的最大吸收波长也在260 nm处，两者的最大吸收波长