线粒体ND4基因12026A→G变异及2型糖尿病关联统计分析.docVIP

线粒体ND4基因12026A→G变异及2型糖尿病关联统计分析 　　糖尿病是最常见的内分泌代谢性疾病，是一种多基因疾病，遗传因素在糖尿病的发生发展中起着重要的作用，近年来学者们应用分子生物学技术，研究糖尿病的候选基因，探讨其遗传学发病机制。文献报道，在不同种族、不同地区的2型糖尿病患者中线粒体基因的突变率不同，线粒体基因突变与糖尿病关系的观点不一［1，2］。本研究对延边地区328例2型糖尿病患者(其中80例有家族史)及108例正常对照组线粒体DNA ND4基因进行突变分析，旨在探讨延边地区T2DM患者线粒体DNA基因变异情况及线粒体基因变异与2型糖尿病的相关性。 　1　资料与方法 　11　研究对象　随机选取在延边大学附属医院健康体检者108例：男65例、女43例，平均年龄(304plusmn;97岁)作为正常对照组，临床和实验室检查均正常，排除肝、肾、内分泌和心脑血管疾病，近3个月无服用任何药物史；选取2009年12月至2012年2月在延边大学附属医院内分泌科住院的2型糖尿病患者328例：男194例、女134例，平均年龄(351plusmn;69)岁。糖尿病诊断依据1999年WHO诊断标准，排除妊娠、急性感染、肿瘤、外伤、心、肝疾病及服用羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂、血管紧张素转换酶抑制剂、噻唑烷二酮类药物者。根据线粒体DNA基因变异情况将T2DM患者分为基因变异组和基因非变异组。所有受检对象均为延边地区无血缘关系个体，均签署知情同意书。 　12　研究方法　① 　基因组DNA提取:采用Promega公司生产的Wizard@ Genomic DNA Purification Kit提取DNA。取被受检者肘静脉血2 ml到加有EDTA抗凝剂的真空采血管中，并立刻颠倒混匀，置于离心机中3000转离心10 min，取300 mu;l白细胞加入到15 ml离心管中，按照细胞裂解、核裂解、RNA去除、沉淀蛋白质、析出DNA、清洗DNA、水化DNA的过程分别加入试剂，进行DNA的提取。所得DNA经紫外分光光度计定量，并置于70℃保存备用。②PCR扩增mtDNA ND4区域基因片段，根据GenBank中所报告的序列参考文献报道［3］，采用北京华美公司合成的上游引物上游引物：5TTT ACCACAACACAATGGGG3，下游引物5AAGGGGTCGTAAGCCTCTGT3；PCR扩增体系(50 mu;l):包括5times;Green GO Taq Buffer 10 mu;l,MgcL2 2 mu;l，dNTP 1 mu;l，上游1 mu;l，下游1 mu;l，Taq DNA聚合酶,025 mu;l，灭菌注射用水2975 mu;l，DNA 5 mu;l；PCR循环参数：95℃预变性5 min，95℃变性30S，60℃退火30S，72℃延伸30S，循环35次，最后72℃延伸10 min。用2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。③PCR产物的限制性酶切：20 mu;l酶切体系包括PCR产物5 mu;l，HincII内切酶 05 mu;l，灭菌注射用水145 mu;l，置于37℃水浴箱中水浴3 h。5%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。④PCR扩增产物直接测序：PCR产物用凝胶电泳DNA回收试剂盒纯化回收DNA片段后，送北京奥莱博生物技术有限责任公司，完成PCR扩增产物测序。 论文代写 　13　统计学方法 　用SPSS 170软件包进行分析。主要检测指标均进行资料分布类型检验和方差齐性检验，正态分布的各统计指标以均数plusmn;标准差(xplusmn;s)表示，行t检验，率的比较行chi;2检验。 　2　结果 　21　线粒体DNA ND4(nt1199012199)区域经PCR扩增后得到产物片段长度为209bp(见图1)，限制性内切酶HincⅡ酶切识别位点为GTYdarr;RAC(R=A或G,Y=G或T)，线粒体DNA 12026位点发生变异时将被分割成171bp和38bp两个片段。(见图2)。直接测序发现线粒体基因12026位点发生Ararr;G变异(见图3)。 　22　在328例2型糖尿病患者中共检出线粒体DNA 12026 Ararr;G变异20例，其变异率为61%；在108例对照组中检出线粒体DNA 12026 Ararr;G变异1例，其变异率为09% (chi;2=4740，Plt;005)(见表1)。23　2型糖尿病患者中线粒体基因12026Ararr;G变异组与非变异组在空腹血糖，糖化血红蛋白及肌酐比较有统计学差异，Plt;005；在病程，体重指数，餐后2 h血糖等临床资料比较无统计学差异，Pgt;005(见表2)。