组织微阵列方法检测CD31、CD105、v-WF、PCNA在肝癌组织中表达.doc

组织微阵列方法检测CD31、CD105、v-WF、PCNA在肝癌组织中表达 　【摘要】 ［目的］ 探讨MVD-CD31、MVD-CD105、MVD-v-WF及PCNA的表达与肝癌生物学行为的关联。［方法］ 构建包含38例肝癌及癌旁组织的组织微阵列，以免疫组织化学方法检测MVD-CD31、MVD-CD105、MVD-v-WF及PCNA的表达，同期应用免疫荧光双染色法检测CD31及PCNA表达。［结果］ 肝癌组织MVD-CD31均值为48.5±29.7，而癌旁组织MVD-CD31均值为24.2±22.3，差异有显著性（P＜0.01）；PCNA高表达的肝癌组织MVD-CD31均值（68.3±36.9）显著高于PCNA低表达的肝癌组织（37.9±30.9，P=0.012）。MVD-CD105及MVD-v-WF在肝癌组织及癌旁组织分别为22.4±12.3和15.9±11.7；21.5±13.3和34.0±16.7，差异无显著性。存在肝内转移的肝癌组织MVD-CD105均值为28.4±19.4,而无肝内转移的肝癌组织MVD-CD105均值为5.4±5.2，差异有显著性（P＜0.01）；存在肝内转移的肝癌组织及无肝内转移的肝癌组织MVD-CD31及MVD-v-WF分别为66.6±39.4和44.9±32.9；25.2±15.2和19.7±9.9，差异无显著性。［结论］ MVD-CD31与肝癌增殖状态相关，MVD-CD105与肝癌肝内转移相关，肿瘤新生血管可能在肝癌发生演进过程中起重要作用。 【关键词】 肝肿瘤 新生血管形成是肿瘤生长、转移的前提，目前，作为多种肿瘤预后标志的肿瘤组织微血管密度（microvessel density，MVD）受到广泛关注[1]。通过染色内皮细胞标志分子反映肿瘤血管是目前常用的技术手段。研究表明，不同内皮标志分子反映肿瘤血管能力并不相同，与临床参数关联亦存在差异；同一内皮标志分子在不同肿瘤中，也可能具有不同的意义[2]。因而，研究不同肿瘤的内皮细胞标志分子与肿瘤生物学行为的关联，对选择有效反映肿瘤组织微血管的内皮标志分子有指导意义。血管播散为肝癌的主要转移形式，不同血管标志分子，如CD31、CD105、v-WF与肝癌生物学行为是否存在关联尚不明晰。组织微阵列是快速、均匀检测众多样本蛋白表达的技术[3]。我们采用组织微阵列技术研究了MVD-CD31、MVD-CD105、MVD-v-WF及PCNA在38例肝癌标本中的表达，初步探讨它们表达与肝癌临床病理参数之间的关联性。 1 材料与方法 38例肝癌根治性切除组织标本，为我院1999~2004年收治的患者。平均年龄64岁，女性7例，男性31例。平均肿瘤大小6.6cm，其中13例小于3cm，38例患者中，丙型肝炎感染者27例，乙型肝炎者6例。新鲜组织标本10%福尔马林固定，石蜡包埋。 1.1 肝癌组织微阵列的构建 应用Tissue Arrayer(Beecher instvumeuts Znc)构建肝癌组织微阵列，操作按说明书进行，直径为2mm。在HE切片上选择合适的肿瘤区域，避免坏死区域。每例组织，分别选择肿瘤中心部位、肿瘤与肝组织交界部位及残留非癌肝组织部位，各例组织制作组织学芯片。切取4μm切片供HE染色和免疫组织化学检测用。 1.2 CD31、CD105、v-WF及PCNA免疫组织化学染色 系列组织微阵列分别与CD31、CD105、v-WF及PCNA单克隆抗体（Dako，Denmark）进行免疫组织化学染色。免疫组化SP法，选择PBS作为阴性对照。 1.3 结果判定 1.3.1 MVD-CD31、MVD-CD105、MVD-v-WF表达 微血管密度(MVD) 测定参照Weidner[4]的微血管计数方法：首先，于低倍镜(×40) 下观察全部视野，选择3 个富含管组织的“热点”区，即棕黄染色密度最高的区域。然后，在高倍镜(×400)下双盲法计数微血管。呈现单个或聚集在一起的数个被染为棕黄色或棕褐色的内皮细胞，独立于邻近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织，作为1个微血管计数，计数3个视野，取其均值作为MVD。管腔大于8 个红细胞直径或管壁带有肌层的大血管不作为新生血管计数。 1.3.2 PCNA表达 核染色阳性细胞与计数细胞之比称为PCNA阳性细胞率：＜1%为0；1%~20%为1；21%~50%为2；＞50%为3。2与3为PCNA高表达。 1.4 CD31及PCNA的免疫荧光双染色 组织微阵列二甲苯脱蜡，柠檬酸缓冲液加热修复抗原。4℃ 1∶50稀释的鼠抗人PCNA单克隆抗体孵育18h。PBS 冲洗5min，2次。然后与1∶200稀释的共轭联连FITC的免抗鼠IgG抗体（Dako Denmark）闭光37℃孵育30min[5]，PBS冲洗，