耻垢分枝杆菌glmU基因克隆、 表达及多克隆抗体制备.doc

耻垢分枝杆菌glmU基因克隆、 表达及多克隆抗体制备 　 作者：张文利, 申慧, 辛毅, 马郁芳 【摘要】 　　目的: 制备抗耻垢分枝杆菌（Smeg）GlmU 的多克隆抗体, 并对其特异性进行鉴定。方法: 用PCR技术扩增Smeg glmU, 构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒pET29bSmeg glmU, 用IPTG诱导表达, 经NiNTAAgarose柱层析纯化后, 以其为免疫原制备抗Smeg GlmU 的多克隆抗体, 并以间接ELISA方法测定抗体效价, 以Western blot方法鉴定抗体的特异性。结果: 在大肠杆菌中得到了可溶性表达的Smeg GlmU; 以其免疫小鼠获得抗血清, Western blot鉴定显示获得了能特异性地作用于耻垢分枝杆菌GlmU的多克隆抗体, ELISA测定表明其效价高于1∶6 400。结论: 获得了能特异性地作用于耻垢分枝杆菌GlmU的高效价多克隆抗体, 为应用反义RNA技术研究glmU基因的功能奠定了基础。 【关键词】 GlmU 多克隆抗体 分枝杆菌 　　耻垢分枝杆菌 GlmU为glmU (Smeg glmU) 所编码的产物, 是一种双功能酶, 在 GlcNAc 的活性前体 UDPGlcNAc 的合成过程中催化两步连续的反应: （1）1磷酸葡萄糖胺被 GlmU的乙酰基转移酶活性催化生成1磷酸N乙酰葡萄糖胺。（2）1磷酸N乙酰葡萄糖胺在 GlmU的尿嘧啶转移酶活性催化下生成终产物UDPN乙酰葡萄糖胺［1, 2］。由于 GlcNAc 是分枝杆菌细胞壁中的重要成分肽聚糖和GlcNAc鼠李糖二糖连接物的必需组成成分, 故推测 GlmU 将对分枝杆菌的生长具有不容忽视的作用。本室已经开展了对GlmU 的研究, 成功构建了glmU基因被敲除的耻垢分枝杆菌模型, 并通过此模型证实了glmU基因是分枝杆菌生长所必需的基因, 为GlmU可作为药物的靶点提供了客观依据 (数据尚未发表)。为了进一步明确GlmU在分枝杆菌内的功能, 本室又构建了对Smeg glmU的反义RNA, 以期通过定向地调控Smeg glmU基因的表达来探讨glmU基因的功能。在应用反义RNA技术进行研究时, 要监测到 GlmU 在蛋白质水平的变化, 这就需要有抗GlmU的抗体, 而目前市场上并没有这样的抗体出售, 为进一步研究GlmU的功能, 我们克隆和表达了Smeg glmU基因, 并应用纯化的表达产物制被抗 Smeg GlmU 的多克隆抗体。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 pMD18T 克隆载体购自宝生物工程 (大连) 有限公司; E.coli NovaBlue 菌株、 E.coli BL21(DE3)菌株和pET29b表达载体购自美国Novagen公司; 耻垢分枝杆菌mc2155菌株购自ATCC公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 目的基因glmU获取及其克隆的构建 在 TIGR 网站 (/tdb/)数据库中, 获取mc2155菌株glmU基因的核苷酸序列(1449 bp)。根据获得的基因序列设计PCR引物, 分别为: 上游引物glmUF: 5′CATATGACCGCATCAACCGAGGCCGCG3′, 其中具有下划线的序列为 Nde I酶位点; 下游引物glmUR: 5′CTCGAGGCTCTCGTCGCCCAACGCCTTG3′, 下划线的序列为Xho I 酶位点。以 mc2155 基因组DNA为模版, glmUF和glmUR为引物, 用LA Taq DNA聚合酶进行PCR反应扩增目的基因Smeg glmU, 回收、 纯化PCR产物, 并将其克隆进pMD18T载体产生克隆质粒pMD18Smeg glmU, 并将其转化入E.coli NovaBlue 细胞中进行扩增。提取质粒 pMD18Smeg glmU, 应用Nde I/Xho I双酶质粒 DNA 鉴定重组质粒, 选取其中被鉴定正确的pMD18Smeg glmU送至日本宝生物工程（大连）有限公司, 用RVM 和M1347测序引物对重组质粒中的Smeg glmU基因进行序列测定。将 DNA 测序结果与 mc2155 glmU基因序列进行比对, 确定所克隆的glmU基因序列的正确性。 　　1.2.2 表达载体pET29bSmeg glmU的构建 应用Nde I/Xho I将pMD18Smeg glmU上的Smeg glmU切割下来, 并亚克隆进经过同样Nde I/Xho I双酶作用的载体pET29b上, 产生 pET29bSmeg glmU。提取重组质粒DNA, 并分别用Nde I/Xho I双酶切及Sma I单酶切两个反应来鉴定pET29bS