肝癌干细胞中差异表达miRNAs对肝癌干细胞增殖及转移影响.docVIP

肝癌干细胞中差异表达miRNAs对肝癌干细胞增殖及转移影响 　摘　要：目的：探讨肝癌干细胞较卵园细胞中高表达的miRNAs（hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-122）对肝癌干细胞增殖和转移的影响。方法：分离培养肝癌干细胞，构建并转染肝癌干细胞中差异表达的miRNAs寡核苷酸，通过MTT实验、裸鼠成瘤实验、裸鼠脾脏转移实验观察干扰hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-122的表达后肝癌干细胞增殖和转移能力。结果：采用寡核苷酸干扰hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-122的表达后，肝癌干细胞增殖能力较对照组显著减弱，裸鼠成瘤实验中形成的肿瘤显著小于对照组，脾脏肿块及肝转移肿瘤显著小于对照组。结论：hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-122能够增强肝癌干细胞增殖，促进其成瘤及转移。 关键词： miRNA；肝癌干细胞；增殖；转移 对miRNAs的研究正如火如荼般地进行着，人们发现很多miRNA是肿瘤发生、形成及转移的重要调节因子，抑制肿瘤形成的miRNA通常以低水平状态表达，而促进肿瘤生长及转移的miRNA则在肿瘤及肿瘤细胞中呈高水平表达。很多文献报道miRNA与肿瘤细胞的增殖和转移有关，而肝癌干细胞具有强大的增殖能力，在肝癌发生发展中可能起重要的作用[1-11]。若能成功地把miRNAs和肿瘤干细胞整合起来进行研究将是探讨肿瘤早期诊断、预防与治疗的新思路。实验室课题组人员之前采用miRNA芯片比较了肝癌干细胞与卵园细胞中差异表达的miRNA，并选择其中部分表达差异较大的miRNA进行Northern杂交验证，发现hsa-miR-199a-3p和hsa-miR-122在肝癌干细胞中的表达要明显高于卵园细胞。在文章中，通过寡核苷酸干扰肝癌干细胞中hsa-miR-199a-3p和hsa-miR-122的表达，随后通过MTT观察肝癌干细胞的增殖能力，并通过裸鼠成瘤能力及脾脏转移能力等实验观察肝癌干细胞的成瘤及转移能力。 1 资料与方法 1.1 一般资料：实验动物和试剂：本实验中所用裸小鼠为4～6周雄性裸小鼠（BALB/c-nu/nu），体重15～20 g，由南方医科大学动物实验中心提供，饲养于清洁级饲养室，提供正常光照及自由摄食条件。MEM培养基购自Hyclone，胰酶购自Sigma，胎牛血清购自杭州四季青公司，寡核苷酸由三博远志公司提供，转染试剂lipo2000、MTT试剂盒购自Promega。 毕业论文 1.2 实验方法和步骤 1.2.1 肝癌手术标本选取：取3例肝癌患者手术后标本进行实验。 1.2.2 肝癌干细胞样细胞培养，分离与鉴定：取处于对数生长期的肝癌细胞，有限稀释法单克隆分离、培养肝癌干细胞；裸鼠成瘤实验验证其成瘤能力后，观察高成瘤能力，有分化能力的肿瘤细胞即为肝癌干细胞样细胞。 1.2.3 肝癌干细胞转染microRNA反义寡核苷酸：分别取对数生长期的肝癌干细胞，调整细胞的浓度为7.5×105/ml。在48孔板中，每孔加入细胞悬液200 μl，细胞数为15 000个/ml，设3个空白对照孔，置37℃ 5% CO2孵箱培养。利用肝癌干细胞及卵园细胞miRNA表达不同的miRNA，设计待测的microRNA的反义寡核昔酸（DNA）和反义2’-0一甲基RNA，将脂质体与反义寡核苷酸加入到相应量的无血清培基中进行稀释，稀释后的脂质体分别加入到反义寡核苷酸作用15 min备用。取出48孔培养板，洗涤后每孔各加入100 μl上述混合液，（细胞对照孔只加100 μl无血清培基），设3个复孔，37℃，5% CO2孵箱，4 h后每孔补加1640培养液大鼠100 μl，在培养24 h后取出培养板换液继续培养。 1.2.4 MTT法测量特征microRNA功能：在培养72 h后取出培养板（包括转染miRNA反义寡核苷酸细胞与对照组细胞），每孔加MTT40 μl（5 mg/ml），继续培养4 h。取出培养板，离心5 min，每孔加200 μl DMSO终止反应并溶解甲基蓝紫色颗粒，震荡混匀，酶标仪测波长为570 nm的各孔吸光度值（OD570）。 1.2.5 裸鼠成瘤能力的观察：转染miRNA反义寡核苷酸细胞与对照组细胞继续培养，调整细胞密度为5×107/ml，取0.2 ml细胞悬液注射到裸鼠左侧腋背部皮下，观察裸鼠移植肿瘤生长情况，1个月裸鼠移植肿瘤测重。 1.2.6 裸鼠脾脏转移潜能的观察：转染 miRNA反义寡核苷酸细胞与对照组细胞继续培养，调整细胞密度为3×106/ml。裸鼠麻醉后固定于实验架上，无菌条件下行左肋下0.5 cm处暴露脾脏。取0.3 ml，细胞悬液缓慢注入脾脏被膜下1/3处。注射完毕后，用质量分数75%乙醇压迫止血并杀死外渗的癌细胞。脾脏回纳入