胆固醇结石患者胆汁凝血因子及纤维蛋白及结石形成关系探究.docVIP

胆固醇结石患者胆汁凝血因子及纤维蛋白及结石形成关系探究 　 作者：叶生爱，秦永林，韩天权，芦慧霞，王凤臣，高乃荣，嵇振岭，杨德同，张圣道，汤文浩 ［摘要］目的: 通过研究胆囊胆固醇结石（简称胆石）患者胆石或胆囊胆汁中的纤维蛋白和凝血因子来阐明纤维蛋白在胆固醇结石形成中的作用。 方法: 收集胆石患者胆囊胆汁25份及非胆石患者胆囊胆汁15份，测定凝血酶原片段1+2（F1+2）、抗凝血酶Ⅲ抗原与活性、纤溶酶消化前后D.二聚体及总蛋白水平。取胆石15枚，制作成石蜡切片，分别行PAS染色、纤维蛋白和因子免疫组织化学染色。 结果: 胆石患者胆汁中F1+2、抗凝血酶Ⅲ抗原、抗凝血酶Ⅲ抗原含量与活性之比、D.二聚体、总蛋白和纤维蛋白含量均高于非胆石组（Plt;0.05或Plt;0.01）;抗凝血酶Ⅲ活性却低于非胆石组（Plt;0.05）;胆石组胆汁经纤溶酶消化后D.二聚体水平显著升高（Plt;0.01）。胆石中的蛋白提取物经纤溶酶消化后可检测到D.二聚体。胆石切片PAS染色、纤维蛋白和 因子免疫组织化学染色均呈现阳性网状结构分布。 结论: 胆石患者的胆汁处于“血栓前”状态，成石胆汁中有大量的交联纤维蛋白生成与累积;纤维蛋白与 因子参与了胆石网状结构的形成。 　　［关键词］ 胆固醇结石;凝血因子;纤维蛋白 　　自1969年Okamoto首次从人胆囊胆汁中提纯出纤溶酶原激活物胆激酶后，1997年Scott.Coombes［1］ 又报道，在胆囊胆固醇结石（简称胆石）患者的胆囊胆汁中有组织型纤溶酶原激活物（t.PA）、尿激酶型纤溶酶原激活物（u.PA）、纤溶酶原激活物抑制剂1和2（PAI.1、PAI.2）存在，其中t.PA、u.PA与非胆石组相比无明显差异，而PAI.1、PAI.2却明显高于正常胆汁。本实验组在先前的研究中通过对胆汁中抗凝血酶Ⅲ、纤溶酶活性、α 2 .抗纤溶酶活性、PAI.1和D.二聚体等指标的研究发现，胆石患者胆囊胆汁处于一种“高凝”和相对低纤溶状态［2］ ，随后又发现在成石胆汁中含有大量的组织因子（TF）和低水平的组织因子途径抑制物（TFPI）［3］ 。组织因子是凝血过程的重要启动因子，“高凝”状态可导致纤维蛋白的产生，而胆汁中高水平的PAI.1、PAI.2将会影响到交联纤维蛋白的清除。前人的实验提示在成石胆汁中可能有大量的交联纤维蛋白产生和累积。本实验旨在进一步对胆汁和胆石中的凝血因子与纤维蛋白进行研究，阐明纤维蛋白在胆石形成中的作用。 　　1 对象与方法 　　1.1 研究对象及标本制作 　　胆石患者25例:男性8例，年龄30～70岁，中位年龄50岁;女性17例，年龄35～66岁，中位年龄56岁。非胆石患者15例，为同期住院的上腹部手术患者:男性9例，年龄37～69岁，中位年龄58岁;女性6例，年龄40～68岁，中位年龄50.5岁;均经B超确诊无胆囊结石与胆管结石。病例的选择均符合以下条件:体重lt;150%标准体重，无高血压、高血脂或糖尿病，肝肾功能正常，无出血或血栓性疾病，术前血小板计数、PT和APTT正常，近1个月未急性发作，未服用非甾体类抗炎药、胆汁酸制剂或钙拮抗剂等，口服胆囊造影显影，女性患者近期未服用避孕药且未妊娠。两组患者开腹后立即用细针穿刺胆囊，尽可能吸尽全部胆汁。抽出的胆汁立即分成5或6份，蓄于Eppendoff管中，-70℃冻存备用。收集胆石15人份，蒸馏水冲净结石表面的胆汁与碎屑，用无菌刀片将结石剖成两半，真空冻干保存至恒重，一半用于制作切片，一半用于蛋白提取。胆石患者的胆石均为傅培彬8类分类法中的第1、2和3类。 　　1.2 检测指标与方法 　　（1）将胆汁在37℃迅速解冻后，4℃10000×g离心10min，取上清测凝血酶原片段1+2（prothrombin fragment1+2，F1+2）、抗凝血酶Ⅲ抗原及活性、D.二聚体水平;取10μl胆汁，采用考马斯亮蓝法测定总蛋白量［4］ ;另取100μl胆汁用纤溶酶稀释液稀释至190μl，加0.1g#12539;L -1 的纤溶酶10μl，37℃孵育2h后加入抑肽酶至终浓度300MIU#12539;L -1 ，4℃10000×g离心10min，取上清测D.二聚体水平。（2）取一半胆石标本，在液氮中碾碎，称取100mg胆石，经反复提取除净胆固醇后其残渣用N 2 吹干，加稀释液100μl，再加0.5g#12539;L -1的纤溶酶10μl，37℃孵育24h后加入抑肽酶至终浓度 为300MIU#12539;L -1 ，4℃10000×g离心10min，取上清测D.二聚体水平。（3）胆石的组织化学研究:取另一半胆石标本参考AMeX法［5］ 固定后，采用石蜡切片火棉胶增强技术［6］ ，在蜡块削出完整平面时，用2%火棉胶于蜡块表面迅速涂胶，并用冷风