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脑心康片对大鼠脑缺血保护机制探究 　 作者：李卉，苏云明，孟妍，李环，张学会 【摘要】 目的观察脑心康片对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，进一步探讨其作用机制。方法采用大鼠大脑中动脉线栓法制备不完全脑缺血模型，观察脑心康片给药前后大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠神经功能缺损导致的行为学变化；流式细胞术检测脑心康片对MCAO模型大鼠急性脑损伤细胞凋亡的影响；免疫组织化学法检测脑心康片对脑缺血后24，48，72 h脑组织COX2蛋白表达的影响。结果大鼠脑缺血再灌注损伤后24，48，72 h脑组织中COX2阳性细胞平均灰度值及神经元细胞凋亡率模型组与假手术组相比，差异有显著意义（Plt;0.01）；给药后脑心康高、中、低剂量组与银杏叶片组相比，差异有显著意义（Plt;0.01或Plt;0.05）；给药后脑心康高、中、低剂量组与尼莫地平组相比，差异有显著意义（Plt;0.01或Plt;0.05）。结论脑心康片对脑缺血具有保护作用，并遵循一定的时效关系和量效关系，其机制可能与降低缺血脑组织神经元的凋亡率，抑制COX2蛋白的表达有关。 【关键词】 脑心康片； 脑缺血； 再灌注损伤； 细胞凋亡； COX2 脑血管疾病是神经系统的常见病、多发病，是目前引起人类死亡的三大疾病之一。缺血性脑卒中是多种原因引起的一种临床病理状态,其脑组织损害是产生临床征象的病理基础。在本病的预防、治疗和康复方面，中医药具有较为显著的疗效和优势［1］。临床应用脑心康片治疗脑缺血，取得满意疗效。本文旨在通过对大鼠脑神经损伤的行为学改变、细胞凋亡率和凋亡相关基因COX2蛋白表达的观察，探讨脑心康片对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及其作用机制。现报道如下。 　　1 材料 　　1.1 动物Wistar大鼠，雄性，体质量（200±20）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：黑动字大鼠自由进食、饮水，同等条件下饲养，手术前12 h禁食，不禁水。 　　1.2 药品与试剂脑心康片由蝙蝠葛酚性碱50%、水蛭素50%组成，黑龙江中医药大学实验中心制备。尼莫地平片，天津中央药业有限公司生产。银杏叶片，唐山荣大药业有限公司生产。COX2抗体（COX2山羊抗兔IgG多抗）稀释度：1:100，Santa Cruz公司。HRP标记的链霉卵白素-亲和素SP试剂盒、 S/P两步法检测试剂盒、PV6001二步法检测试剂盒、兔抗山羊IgG/HRP、 山羊抗鼠IgG/HRP， DAB显色试剂盒 ，均由北京中杉金桥生物技术有限公司生产。 　　2 方法 　　2.1 分组及给药方法Wistar大鼠雄性70只，体质量（200±20）g，按照体质量随机分为7组，每组10只。即脑心康片高剂量组（100 mg/kg）、脑心康片中剂量组（50 mg/kg）、脑心康片低剂量组（25 mg/kg）、尼莫地平组（21.6 mg/kg）、银杏叶片组（135 mg/kg）、模型对照组和假手术组（分别给等体积生理盐水）。各组均连续灌胃给药7 d，末次给药30 min后手术。 　　2.2 大鼠脑缺血再灌注模型制备采用大鼠大脑中动脉线栓法制备不完全脑缺血模型，末次给药30 min 后，20%乌拉坦（1 g/kg，ip）麻醉，分离并结扎双侧颈总动脉及迷走神经45 min，然后松开再灌注2 h。假手术组只暴露血管不结扎，其余组均按照上述过程操作。 　　2.3 实验指标的检测方法在造模手术完成3～5 h，待大鼠苏醒后，能够完全自主活动时，进行第1次神经功能评分；分别于末次给药后24，48，72 h进行第2次神经功能评分。行为学评分后处死动物，迅速取出大脑置于冰盘上。将大脑分成两半，取左侧大脑皮层脑组织2 g制成单细胞悬液，检测大鼠神经细胞凋亡率。取右侧大脑制成1%的脑组织匀浆，采用免疫组织化学法检测大鼠脑组织COX2蛋白表达。 　　2.4 统计方法所有数据以±s表示，组间比较用t检验。 　　3 结果 　　3.1 脑心康片给药前后各组大鼠神经功能缺损评分情况 　　结果见表1。表1 各组大鼠神经功能缺损评分的基本情况（略） 　　由表1可见，模型组与假手术组相比，差异有显著性意义（Plt;0.01），说明造模是成功的。经药物治疗后，药物治疗各组的大鼠神经功能缺损评分积分治疗前与治疗后比较，及药物治疗后的神经功能缺损评分积分与模型组的比较，均具有极显著差异，P＜0.01，说明各治疗药物对脑缺血均具有显著的治疗作用，能明显改善神经功能缺损，使大鼠因脑缺血导致的行为障碍得到部分改善，但还未达到完全恢复的程度，即与假手术组比较，P＜0.01。且72 h脑心康片治疗组的疗效优于24 h治疗组（高剂量），差异显著，P＜0.05，说明脑心康片对脑缺血的保护作用存在着一定的时效关系。 　　　3.2 脑心康片对细胞