脑益康对阿尔茨海默病模型大鼠脑组织内β淀粉样蛋白及其产生通路.doc

脑益康对阿尔茨海默病模型大鼠脑组织内β淀粉样蛋白及其产生通路 　 作者：缪丽莉 周爱玲 朱燕 施海燕 【摘要】 目的通过建立阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）大鼠模型,观察脑益康对AD大鼠学习记忆能力、β淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein, β-APP）裂解途径的影响，探讨脑益康改善AD模型大鼠症状的机制。方法采用β淀粉样蛋白毒性片段－(β-amyloid protein25－35，Aβ25－35)海马注射建立AD大鼠模型,用电迷宫刺激器检测大鼠学习记忆能力；免疫组织化学方法观察大鼠脑组织Aβ40/42表达的变化；逆转录－聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction ,RT-PCR）方法检测大鼠海马β-APPmRNA表达情况；Western-Blot方法测定大鼠皮层组织β位点剪切酶（β-amyloid precursor protein cleaving enzyme，BACE1）的表达。结果脑益康能提高AD模型大鼠的学习、记忆能力；抑制AD大鼠脑组织Aβ40/42的生成；下调 AD大鼠海马β-APPmRNA的表达；减少AD大鼠脑皮层内BACE1蛋白的含量。结论脑益康减少脑内Aβ的沉积可能是通过抑制BACE1从而下调β-APP的表达而实现的。 【关键词】 阿尔茨海默病 脑益康 学习记忆 β淀粉样蛋白 β淀粉样前体蛋白 β-分泌酶 阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）又称老年性痴呆，是一种以记忆力减退、认知功能障碍为特征的中枢神经系统变性疾病，其主要病理学特征之一是脑组织特别是海马区出现大量老年斑（Senile plaque,SP）［1］。研究发现β淀粉样蛋白(β-amyloid protein ,Aβ)是SP的主要毒性成分。Aβ主要来源于β淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein, β-APP）的裂解，β-APP在水解产生Aβ的过程中涉及3种分泌酶，分别是α，β和γ-分泌酶，其中β-分泌酶（β-amyloid precursor protein cleaving enzyme,BACE1）在生成Aβ的过程中起到了关键性的作用［2］，被认为是防治AD药物的重要靶点。脑益康由制首乌、巴戟天等组成，有效成分多，药理作用广泛，可多系统、多层次、多途径、多靶点的发挥药理作用。本实验采用Aβ25－35微量注射入大鼠海马建立AD大鼠模型，观察脑益康对AD大鼠学习记忆能力、脑内Aβ的生成、β-APPmRNA以及β-APP裂解途径中关键酶－BACE1表达的影响。 　　1 材料与仪器 　　1.1 动物 雄性SD大鼠，SPF级，体重（230±10）g，由南通大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(苏)2002-0022。标准鼠饲料常规喂养。 　　1.2 药物与试剂 脑益康由制首乌、巴戟天等组成（南通市中医院制剂室制成颗粒剂，每克颗粒含生药1.98 g）；脑复康（吡拉西坦片，南京白敬宇制药厂生产，批；Aβ25－35（Sigma公司，美国）；Rabbit anti-human beta-amyloid 1-40/42 polyclonal antibody(CHEMICON公司)；BACE1抗体 (北京博奥森生物技术有限公司)；山羊抗兔IgG免疫组化试剂盒（北京中衫生物工程有限公司，批号：SP9001）；引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒﹑免疫印迹化学发光试剂（BeyoECL Plus）（均购自海门碧云天生物技术研究所）。 　　1.3 仪器 大鼠脑立体定位仪（美国Stoelting公司）；Y-型（MG-B型）迷宫刺激器（张家港市三兴教学机械厂）；冰冻切片机（LAICA CM1900，德国）；PTC-100PCR仪（美国Bio-rad公司）；Mini protein-3电泳装置（美国Bio-rad公司）；Trans-blot转印槽（美国Bio-rad公司）。 　　2 方法 　　2.1 分组、造模与给药 用电迷宫刺激器筛选出学习记忆能力正常的SD大鼠48只，随机分为6组：假手术组，模型对照组及阳性药脑复康（0.4 g·kg-1·d-1）对照组，脑益康小、中、大剂量组（1.73，3.45，6.90 g·kg-1·d-1）。其中，脑益康中剂量相当于临床用量，每组8只。将大鼠用10％水合氯醛（4 ml·kg-1）腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪，颅顶部剪毛，碘酒和酒精消毒后，无菌条件下切开皮肤，分离颅骨外骨膜，显露前囟，记录前囟A（矢状轴）、L（冠状轴）、V （垂直轴）的坐标，参照《大鼠脑立体定位图谱》确定右侧海马CA1区位置，定位坐