逆转录定量PCR选择性检测环境样品中的.DOCVIP

逆转录定量PCR选择性检测中的活性 景明1,2 1 苏州环境监测中心江苏 2 同济大学，环境科学与工程学院，上 摘要 以分枝杆菌Mycobacterium spp.）为研究对象，建立了一种逆转录定量PCRReverse Transcription quantitative PCR，RT-qPCR方法，选择性检测中的活性分枝杆菌。结果表明稳定期~144 h）分枝杆菌65基因的RNA转录稳定，细胞内hsp65作为分枝杆菌的定量依据，快速样品中活性分枝杆菌的目的。qPCR，方法能够区分Log数量级的非活性的底物基质对方法的影响较小样品方法相比，RT-qPCR检测实际样品活性分枝杆菌培养法更，线性相关性更加显著。，一种新的检测技术，RT-qPCR快速、准确检测环境样品中的活性分枝杆菌 关键词：RT-qPCR；活性菌；样品 分枝杆菌属（Mycobacterium spp.）许多机会致病菌，会引起的人畜疾病(Marras and Daley 2002)。，在环境样品中已经分离出分枝杆菌，其数目不断增多(Tortoli 2003)存在于环境水体、市政管网室内管网中(Falkinham et al. 2001, Radomski et al. 2010, Dubrou et al. 2013)快速准确检测方法是技术关键。，传统检测方法培养法(Greenbery et al. 2005, Jjemba et al. 2010)。分枝杆菌生长周期缓慢，培养周期长1~2个月）(Fernandez-Rendon et al. 2012)。，已有研究报道，物质缺乏时分枝杆菌进入(Kaprelyants et al. 2000)，无法在培养基上形成菌落，但是仍活性致病性(Liu et al. 2010)在物质充分的条件下恢复(Shleeva et al. 2002, Mukamolova et al. 2003)。因此，无法检测环境样品中的分枝杆菌样品中分枝杆菌的检测鉴定技术(Beumer et al. 2010, Aboagye and Rowe 2011, Kuznetsov et al. 2004)。其中，发展于90年代末的qPCR技术实现了对分枝杆菌的快速定量检测。但是，基于DNA的qPCR检测技术的主要缺点在于不能够区分活性菌与非活性菌，会高估样品中活性菌的数量及相应的卫生学风险，甚至可能产生假阳性结果(Nocker et al. 2007)。基于RNA的PCR检测技术活性菌检测手段之一(Bergeron et al. 2011, Miller et al. 2011)。NA半衰期较短(Maurer 2006)，非活性菌内快速而在活性存在，的指示活性菌的存在。 大量存在的分枝杆菌为研究对象，定量qPCR）选择性环境样品中的活性分枝杆菌基质对检测方法的影响，评估qPCR方法对分枝杆菌的选择性，最后方法实际环境样品分析其灵敏性。 2与方法 2与仪器 Mycobacterium smegmatis，CGMCC1.2621）。 分枝杆菌的培养采用NaCl 5 g，去离子水 1000 mL，琼脂（固体培养基） 15 g，121 ℃ 灭菌20 min。 RT-qPCR所需的及仪器逆转录试剂盒(TaKaRa CodeDRR 037A)，荧光定量PCR试剂盒SYBR? Premix ExTaqTM（Code：）Stepone）均购自ABI。 其他试剂与仪器：全基因组RNA提取试剂盒FastRNA? Pro Soil-Direct Kit (MP Cat:116070050)。全基因组DNA提取采用FastDNA? Spin Kit for Soil (MP Cat:6560200)。高速离心机购自德国Eppendorf 公司；Biosepc-mini核酸蛋白仪购自日本岛津公司。 2.2 实验方法 2的测定 RNA在活性体内的拷贝数稳定，为了其分枝杆菌不同生长周期时的拷贝数，培养法、qPCR及qPCR测定分枝杆菌的生长曲线mL培养稳定的分枝杆菌mL的培养基中，平行样，置于5 ± 2 ℃，150 r·min-1培养。每取一次样，测定细菌浓度（用colony formation unit ，CFU表示）此外mL样品于mL离心管中，r·min-1 离心2 min，上清液，于- 20 ℃DNA的测定；取mL样品于mL离心管中，r·min-1 离心2 min，上清液贮存于- 80 ℃测定。 2.2.2 引物的选择 采用hsp65作为目的。hsp, 2012)。 本研究中采用的目的基因及相应的引物序列见表(Jjemba et al. 2010)。 表1 qPCR采用的目的基因相应引物序列 目的基因 序列( 5-3) PCR产物长度 Tb11 hsp65 ACCAAC