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酶标 （ELISA）综述 张传锋 ELISA的发展 ELISA是酶联接免疫吸附剂测定 ( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ) 的简称。自上世纪70年代初问世 以来，发展十分迅速，目前已被广泛用 于生物学和医学科学的许多领域。 ELISA技术原理 1. 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 2. 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。 3. 酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。 4. 受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记 的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。 5. 此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。 6. 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量 与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定 性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度 （pg-ng/ml水 平），并且重复性好。 以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶 对底 物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验 技术 ELISA的方法 1. 检测抗体的间接法 2. 双抗原/抗体夹心法 3. 检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法 酶标的实验设计方法比较多，但是最常使 用 比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA 间 ELISA 检测方法 1. Abs （吸收光）检测法 2. 荧光检测法 n 荧光强度 （FI） n 荧光寿命 （FL） n 荧光偏振 （FP） n 荧光共振能量转移 （FRET） 3. 发光检测法 n 化学发光 n 生物发光 其中发光有分为快速发光法 （闪光法）、慢速发光法 （辉光法） 技术要点 1. 试剂的制备、材料的准备 2. 反应条件的选择 3. 操作的标准化 试剂及材料的准备 ELISA的主要试剂有 1. 固相的抗原或抗体 2. 酶标记的抗原或抗体 3. 与标记酶直接关联的酶反应底物 固相载体 ELISA反应中最常用的固相载体为聚苯乙烯材料，聚苯乙烯 具有较强的吸附蛋白质的性能。抗体或蛋白质抗原吸附其上 后保留原来的免疫活性，聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式 。在ELISA测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反 应。 抗原、抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面， 这包括通过疏水键、流水/离子键的被动吸附,通过引入其它 活性基团如氨基和碳基的共价结合，以及通过表面改性后的 亲水键结合。 •高结合力酶标板酶标板(High Binding ELISA Plate): 经表面处理后蛋白结合能力大大增强,可达到400-500ng IgG/cm2,主要结合的蛋白分子量 10kD.使用该类板可提供敏感性,并可相对减少包被蛋白的浓度和用量,不足之处为较易产生 非特异性反应.抗原或抗体包被后,以非离子去污剂无法有效地封闭未结合的部位,需使用蛋白 作为封闭剂. •中结合力酶标板(Medium Binding ELISA Plate): 经表面硫水键被动与蛋白结合,适合作为分子量20kD的大分子蛋白的固相载体,其 蛋白结合能力为200-300ng IgG/cm2. 由于该类板所具的仅与大分子结合的特性,适 用于作为未纯化抗体或抗原的固相载体,可降低潜在的非特异性交叉反应.该类板可 以惰性蛋白或非离子去污剂作为封闭液. •氨基化酶标板(Aminated ELISA Plate): 经表面改性处理后拥有带正电荷的氨基,其疏水键由亲水键取代.该类酶标板适合作 为小分子蛋白的固相载体.使用合适的缓冲液和pH值,其表面可通过离子键与带负电 荷的小分子结合.由于其表面的亲水特性和可通过其它交联剂共价结合的能力,可用 于固定溶于Triton-100、Tween 20等去污剂的蛋白分子.该类板的缺陷为由于降低 了疏水性,一部分蛋白分子无法结合;此外,其表面需有效的封闭.由于亲水和共价的 表面特性,使用封闭液必须能够与非反应性氨基集团和所选择的交联剂中任何官能 基团如succinimide、aldehyde和maleimide发生作用。 聚氯乙烯