质粒酶切`鉴定.pptVIP

第一部分 质粒的酶切及电泳鉴定 4，反应体积，通常1到几微克DNA的反应体积可以控制在50到100微升，用20单位的酶来切。 5，反应条件，大多数酶都是37度半小时以上。 6，双酶切 因为不同的酶需要不同的buffer，所以有两种情况： 1) 两种酶是同样的buffer。尽量用同一个公司的酶，这样就跟单酶切操作差不多，可以同时加入两种酶，注意事项是体积和酶量。 2) 两种酶是不同的buffer，先用一种buffer离子浓度底的酶切，电泳检测，单酶切开以后，将产物抽提，沉淀，加入离子浓度高的buffer再酶切。 H2O 5.5 μl 质粒DNA(100 ng/μl) 15 μl 　　 10×酶切缓冲液(K buffer) 2.5μl　　 BamHⅠ(5 U/μl) 1μl HindⅢ 1μl 第二部分 DNA的凝胶回收 传统的DNA回收的方法主要基于降低凝胶的熔点以释放DNA，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收。 现多用公司生产的商品化的试剂盒，其原理是采用凝胶裂解液（如含有降低熔点的NaI）融化凝胶释放DNA后，采用特殊的硅胶树脂吸附DNA后，用洗液洗去杂质，最后用洗脱液洗出DNA。 本次实验采用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司 B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收。 学习核酸片断连接的原理和方法 1、 连接缓冲液的影响： 1） 20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系； 2）10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应； 3）1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性， 4）25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。 5）0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。 注：含有ATP的缓冲液应于-20℃保存，溶化取用后立即放回。 连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引 起ATP分解。 * 分子生物学 2009 实验 * 质粒酶切、鉴定 及DNA片段的凝胶回收 一. 实验目的 1.了解质粒酶切及电泳鉴定原理。 2. 掌握核酸片段的凝胶回收纯化操作技术。 一. 实验原理 限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链DNA 分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA 双链，形成一定长度的DNA 片段。 如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是： EcoRⅠ：G↓AATTC HindⅢ：A↓AGCTT 限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。 _ + 酶切反应系统包括：DNA，酶，buffer，灭菌水 注意：不同公司的酶和buffer系统是不同的，所以一个反应应该用同一个公司的酶和buffer。 1，DNA：自己制备的DNA，样品中不应该有酚，氯仿，酒精，EDTA，盐离子等的污染，以免影响酶的活性。 2，酶：酶量并不是越大越好，酶体积不应该超过总反应体积的1/10。(因为酶是储存在50%甘油中的，而反应体积中甘油的浓度超过5%就会使酶出现星号活性，即切割不应该切的位置)。 3，buffer：不同的酶配有不同的buffer，产品目录和酶的使用说明中会说明该酶用哪种buffer， 有些buffer中需要另外添加BSA。 二. 仪器和试剂 1．主要仪器 （1） 1.5mL塑料离心管（2）微量加样器10μL、100μL、1 000μL 各一支（3）台式高速离心机（120 00r/min）（4）水浴锅、电泳仪、电泳槽 2．材料 重组质粒pMD19-b （插入外源基因大小约500bp） 3．试剂