流式细胞术测定植物因组大小.ppt

* 流式细胞术测定植物基因组大小 流式细胞术(Flow Cytometry,FCM) 流式细胞术，即利用流式细胞计对处在快速直线流动状态中的单细胞活生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术，是20世纪70年代发展起来的一项技术，综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各学科的知识，它是一种自动分析的技术。 流式细胞仪(Flow Cytometer) 集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、流体力学为一体的一种新型高科技仪器。 概念 一 流式细胞术的基本知识 流式细胞术特点 单细胞悬液或生物颗粒 分析速度高 多参数 精度高 当代最先进的细胞定量分析技术 高灵敏度 无害分析和分选 FACSCalibur 流式细胞分析仪 EPICS XL 流式细胞分析仪 国际两大流式细胞仪生产商： BD(Becton Dickinson)公司：FACSCalibur、FACSAria、FACS Vantage Diva等； BC(Beckman Coulter)公司：EPICS XL/-MCL、CytomicsTM FC500系列等。 目前流式细胞仪可分为两类： 台式机和大型机 特点： 光路调节系统固定 自动化程度高 操作简便 使用寿命长 配备1-2根激光 细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析 临床型(BD,FACSCalibur台式机) 大型机(BD,FACSAria科研型) 特点： 分辨率高 选配多种波长和类型激光器 可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板） 适用于高速分选和多色分析 流式细胞仪检测范围 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 细胞结构 特异性抗原 （细胞表面/胞浆/核） 细胞内细胞因子 细胞活性 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细胞功能 细胞信号转导/通路分析 细胞间相互作用 分子共定位与胞内分子转运 细胞形态学 荧光原位杂交 基因表达分析 细胞凋亡 细胞周期分析 白细胞亚群分析 ImageStream成像流式细胞仪 COPASTM 生物分选系统 流式细胞技术的最新突破 分选微型模式生物 COPAS在线虫分选方面的应用，就在 Nature系列杂志上发表了7篇以上的文献 模式动植物研究、大体积细 胞研究及药物筛选等方面 流式细胞仪的工作原理 光学系统 激光光源 光收集系统 液流系统 流动室 液流驱动系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 液流系统：流动室、液流驱动系统 液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱 分选系统 488 nm laser + - Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector FALS Sensor 90LS Sensor Laser 信号检测--散色光 FSC(前角散射光)它反应细胞的相对大小和截面积的大小 SSC (90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化 它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分 数据显示类型 单参数直方图（Histogram） X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系 Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率 二维等高图和密度图 二维点图Dot Plot 便于数据统计 不同的细胞群可以用不同的颜色标记 主要表达方式 Pseudo 3D Plot 3D Plot 利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等)与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量。 二 植物C值分析原理 流式细胞仪计算测量DNA含量实际上是细胞周期的测量，由于细胞核G1期的DNA含量反应一个细胞的倍性，因此常用DNA含量来估计细胞倍性，包括DNA的绝对含量或相对含量。 测量DNA的绝对含量时，须设一个已知DNA含量的标准样品作对照，来换算出DNA的绝对含量。 样品2C DNA含量=[(样品G0/G1峰均值)/ (标准G0/G1峰均值)]