6-亲和.pptVIP

* * * * 问题： 1、珍珠港事件 ---- 蛋白流失，感染 2、急性肾炎 ---- 蛋白流失 * 问题： 1、珍珠港事件 ---- 蛋白流失，感染 2、急性肾炎 ---- 蛋白流失 * 问题： 1、珍珠港事件 ---- 蛋白流失，感染 2、急性肾炎 ---- 蛋白流失 * 乙醇的渗透蒸发分离，选用带-COOH的膜，有利于分离除水（H2O与-COOH形成氢键） 第16章 亲和嫁接技术 目的 电泳 具体专业技术 思想 一点突破 横向联系 如何嫁接 * 第16章 亲和嫁接技术 1 亲和膜过滤 2 亲和错流过滤 3 亲和双水相分配 4 亲和反胶团萃取 5 亲和沉淀 * 1 亲和膜过滤 传统亲和技术存在的问题: 1st 固定床型亲和层析利用多糖凝胶为固定相，床层压降随流速线性增大；由于软凝胶的机械强度较低，容易发生压密现象(受压变形)，在较高压力下，流速随压力提高而下降。因此，利用软产胶为固定相的层析操作速度有限. 2nd 用刚性粒子(如硅胶)为固定相虽然可通过增大压力提高流速，但高压操作势必增大设备投资。 比较? 解决之道? * 1 亲和膜过滤 设计比较: 柱高/直径 = 250/4.6 = 54.3 柱高/直径 = 200/252 = 0.794 Cu-IDA-Seph- arose CL-6B φ252×200 IDA-Sepha- rose CL-6B φ252×100 design? * 1 亲和膜过滤 . 如柱体积一定(即料液处理能力一定) 降低柱高 增大柱径 ?p不变 流速提高 分离速度提高 “短粗”型亲和柱 为使分离速度达到极限值，“理想”的层析柱几何形状应该是柱高等于介质直径 结果? * 1 亲和膜过滤 亲和膜(Affinity membrane)利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。所以，利用亲和膜的纯化方法又称membrane-based affinity chromatography 结果 = 亲和膜 亲和膜吸附分离的原理 * 1 亲和膜过滤 时间比较 1st 外扩散-吸附时间比较: 利用BSA抗体修饰的Sepharose为介质吸附BSA，基于二级反应动力学常数计算的扩散-吸附反应时间为 5s . 2nd 内扩散-吸附时间: 利用tD = L2D/D 计算, BSA在粒径为100 um Sepharose中扩散-吸附所需平均时间为(50?10-4)2/(6?10-7) = 41s， 实验材料比较 优点 1st 传质阻力小, 达到吸附平衡的时间短; 2nd 压降小，流速快; 3rd 设备体积小; 4th 配基利用率高, 配基用量低. 缺点: 1st 从分离效率的角度，因膜的厚度(柱高)很小(一般为10~100 um)，理论板数很低; 2nd 膜的污染和膜孔的堵塞使操作速度、吸附效率和亲和膜的寿命下降. * 1 亲和膜过滤 结果: 利用含10 cm3膜材料的小型亲和膜设备可在15分钟内完成1.2 dm3 粗料液的纯化处理，单抗回收率为97%，其中除去了95%的核酸和99.5% 的牛血清白蛋白 3rd Sepracor公司实验结果表明，利用300美元A蛋白可纯化8万美元的单抗。由于该纯化系统将除菌、纯化和浓缩操作一步完成，分离速度可达到传统层析法的100倍。 应用 1st 螺旋卷式膜组件(美国Cuno Co.) 膜材料: 纤维素 一 A蛋白/ 乙烯配基 操作方式: 流体沿径透过膜组件，中心管流出， 操作压: 低于0.07MPa, 透过流量达100 ~1000 cm3/min 结果: 利用固定化A蛋白吸附各种来源不同的IgG实验表明，每克膜材料吸附7~19 mg IgG，回收率为91 ~100%。 2nd 中空纤维型微滤膜组件(美国Sepracor公司): 膜材料: 纤维素 一 A蛋白 实验: 纯化含血清培养液中的小鼠单抗的实验 Why ? * 2 亲和过滤 4th 利用Cibacron blue F3G-A修饰的微滤膜(膜厚210um，孔径0.45um，修饰密度为7umol/cm3)吸附葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH) 动力学实验结果: 当料液中含有相当于膜吸附容量约67%G6PDH时，0.25s(压力=0.4 MPa，线速度=5cm/min)的平均停留时间就足以使吸附达到饱合。 当G6PDH含量达到膜吸附容量的130%时，所需的平均停留时间不超过1s。 纯化结果: 利用体积仅4.83cm3的亲和膜在9分钟内即完成了0.6dm3