人外周血来源的DC培养技术—— 张秀敏.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 体外培养DC的流式细胞仪检测结果 Control CD1a CD40 HLA-DR CD83 CD86 44.16% 75.04% 95.98% 57.25 % 73.20% PBMC来源DC(7d) 连续贴壁法分离培养人外周血来源DC技术 DC的超微结构观察-正常DC  DC透射电镜（×3K） DC内溶酶体丰富（×13K） 连续贴壁法分离培养人外周血来源DC技术 培养第7d的DC 凋亡DC（×4.5K） 吞噬状态DC （×6K） 培养第15dDC 连续贴壁法分离培养人外周血来源DC技术 DC的超微结构观察 文字内容 采取连续两次贴壁孵育PBMC的方法，以充分收集外周血中CD14+DC前体细胞。此外，在贴壁细胞培养12h后，去除牢固贴壁细胞再继续诱导培养，以尽量排除巨噬细胞对DC培养的干扰。按照我们的改进方案，分离培养出的DC无论是数量还是纯度都高于以往一次贴壁分离培养出的DC。每108的PBMC，经过连续两次贴壁分离培养7天后可获得5×106—1×107个悬浮和半贴壁细胞，光镜观察其中具有典型DC形态的细胞比例大于90%。 小 结 常见问题 红细胞下沉 原因：滴加血液时间过长；叠加血液方法及速度不当。 解决方法：在把稀释后的抗凝血加至分离液面时将毛细管贴近分离液并倾斜离心管后再加血液；按照先慢后快的原则，尽可能短时间内完成，不能超过30分钟。 连续贴壁法分离培养人外周血来源DC技术 常见问题 分离界面不清晰 原因：滴加抗凝血的操作不当；离心速度、时间及温度控制不好；ficoll液温度、血的保存不当。 解决方法：尽量用15ml的离心管分离；稀释血液时混匀不能太用力，否则会溶血；滴加稀释的血液时不要冲破液面；不要振荡离心管；ficoll液要复温；血液常温避光保存，从采血到分离不超过12个小时；离心温度只能在20-25℃。 连续贴壁法分离培养人外周血来源DC技术 常见问题 PBMC不在分离液面 PBMC出现在分离液和红细胞的交界面，而不是在分离液的上面。 原因：离心速度过高；离心机升降速度过快。 解决方法：将离心速度降低，让离心机自然沉降。 连续贴壁法分离培养人外周血来源DC技术 常见问题 DC的获得量低 CD14+前体细胞贴壁不充分，单纯的延长贴壁时间或增加贴壁表面积不能明显增加贴壁细胞数量。 以往一次贴壁分离培养的细胞中，牢固贴壁生长的细胞比例较高，这些细胞在培养过程中极易分化为巨噬细胞，同时拮抗CD14+前体细胞向DC的分化与扩增。 解决方法：采用连续贴壁法分离培养DC，即对PBMC连续贴壁两次，次日取悬浮及半贴壁的细胞诱导分化培养。 连续贴壁法分离培养人外周血来源DC技术 技术创新 改进了PBMC分离方法，提高了PBMC的分离效果。设计了PBMC 分离装置-已授权专利。 建立了连续贴壁培养DC 的方法， DC的获得量及纯度较以前均有明显提高，已发表。 技术创新 PBMC分离装置 16 17 8 10 6 1 2 7 5 4 3 45° 9 I 11 13 14 15 12 18 18 19 专利号： 201120206333.1 发明人：张秀敏，李增山，叶菁，等 * * * * * * * 　　 * * * * * * * * * * * * * 人外周血来源的DC 培养技术 病理学与病理生理学教研室 张秀敏 —— 个体中不同组织的细胞形态 免疫细胞的种类 拉尔夫·斯坦曼 （Ralph Marvin Steinman） 树突状细胞 (dendritic cell, DC) 阿尔伯特·拉斯克基础医学研究奖（2007） 盖尔德纳基金会国际奖（2003） 癌症研究协会威廉·科利奖（1998） 发现树突状细胞及其在后天免疫系统中的作用 树突状细胞(dendritic cell, DC) 树突状细胞是一类在显微镜下看到的像树枝样形状的细胞，是机体免疫系统的控制者，当机体遭遇病原微生物侵袭或体内有细胞发生恶变时，树突状细胞很快即能获知这些信息，并及时传递给免疫系统，将病原微生物或恶变细胞从体内清除出去。 GM-CSF TNF-a IL-4 CD1a、CD11c、CD83 MHC II 协同刺激分子CD80、CD