Raji细胞基因组文库的构建与筛选-中南大学学报医学版.PDF

中南大学学报（医学版） 　２００８，３３（３） ＪＣｅｎｔＳｏｕｔｈＵｎｉｖ（ＭｅｄＳｃｉ） １８５ ·ＡＲＴＩＣＬＥＳ· ·论　著 · Ｒａｊｉ细胞基因组文库的构建与筛选 １ ２ ２ 高建明 ，李小玲 ，李桂源 （１．三峡大学医学院病理生理学教研室，湖北 宜昌４４３００２；２．中南大学肿瘤研究所，长沙４１００７８） ［摘要］　 目的：构建 Ｒａｊｉ细胞基因组文库，用ＥＢＶＤＮＡ探针对文库进行筛选。方法：Ｒａｊｉ细胞基因 组 ＤＮＡ经ＢａｍＨＩ酶切消化后，低熔点琼脂糖回收９～２３ｋｂ的酶切 ＤＮＡ片段，通过匹配黏性末端与磷酸 化的ＬａｍｂｄａＤＡＳＨＩＩＢａｍＨＩ酶切载体臂连接，在体外经包装系统包装成活的重组噬菌体，测定原始文库 与扩增文库的滴度，用同位素标记的ＥＢＶＤＮＡ探针对Ｒａｊｉ细胞基因组文库进行筛选。结果：Ｒａｊｉ细胞原 ５ ８ 始文库与扩增文库的滴度分别为 １．８×１０ 和 ２．８×１０ ｐｆｕ／ｍＬ。文库经筛选获得 ４个阳性克隆，随机 挑取 １个阳性克隆稀释后铺平板作进一步杂交鉴定，发现所有噬菌斑均有杂交信号，证明该克隆确为阳 性克隆。抽提该阳性克隆ＤＮＡ，进行 ＢａｍＨＩ酶切鉴定，证实插入片段的长度为 ８．５ｋｂ。经测序、ＢＬＡＳＴ 序列比对，结果显示插入片段一侧为 ＥＢＶＢａｍＨＩＷ片段，另一侧与人类 １５号染色体 ＲＰ１１６６５Ａ２２克 隆高度同源。结论：Ｒａｊｉ细胞基因组文库的成功构建，为进一步克隆包含 ＥＢＶ整合位点的细胞基因组序 列、探讨 ＥＢＶ整合参与肿瘤发生发展的分子机制奠定了基础。 ［关键词］　 Ｒａｊｉ细胞；　基因组文库；　构建；　筛选 ［中图分类号］　Ｑ７８１　［文献标识码］　Ａ　［文章编号］　１６７２７３４７（２００８）０３０１８５０７ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｇｅｎｏｍｉｃｌｉｂｒａｒｙｆｒｏｍＲａｊｉｃｅｌｌｓ １ ２ ２ ＧＡＯＪｉａｎｍｉｎｇ，ＬＩＸｉａｏｌｉｎｇ，ＬＩＧｕｉｙｕａｎ （１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＴｈｒｅｅＧｏｒｇｅｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＹｉｃｈａｎｇＨｕｂｅｉ４４３００２； ２．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＸｉａｎｇｙａＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１００７８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃｌｉｂｒａｒｙｏｆＲａｊｉｃｅｌｌｓａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｔｂｙＥＢＶ ＤＮＡｐｒｏｂｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＨｉｇｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆＲａｊｉｃｅｌｌｓｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅＢａｍＨＩ．ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｒａｎｇｉｎｇｆｒｏｍ９ｔｏ２３ｋｂｗｅｒｅｒｅｃｏｖｅｒｅｄｂｙａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ ｓｉｓ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｌｉｇａｔｅｄｗｉｔｈＬａｍｂｄａＤＡＳＨＩＩｖｅｃｔｏｒＢａｍＨＩａｒｍｓｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｃａｌｆｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｌ ｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＡＰ）．ＬｉｇａｔｅｄＤＮＡｗａｓｐａｃｋｅｄｉｎｖｉｔｒｏｕｓｉｎｇＧｉｇａｐａｃｋ ｇｏｌｄｐａｃｋａｇｉｎｇｅｘ