动物细胞培养的应用.pptVIP

* * * 单克隆抗体在生物学和医学研究领域中显示了极大的应用价值，是亲和层析中重要的配体，是免疫组化中主要的抗体，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。 单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下： 1．诊断各类病原体这是单克隆抗体应用最多的领域，已有大量的商品诊断试剂供选择。如用于诊断乙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物感染的试剂等。单克隆抗体具有灵敏度高、特异性好的特点。尤其在鉴别菌种型及亚型、病毒的变异株以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。 2．肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单克隆抗体，但对肿瘤相关抗原（例如甲胎蛋白和癌胚抗原）的单克隆抗体早已用于临床检验。 近年来，有人利用单克隆抗体进行肿瘤分型，对制定治疗方案和判断预后也有帮助。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单克隆抗体主要用于体内诊断，结合X线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定位诊断。 3．检测淋巴细胞的表面标志用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。例如检测CD系列标志，有助于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，对多种疾病诊断具有参考意义。对细胞表面抗原的检查在白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面也有指导作用。组织相容性抗原是移植免疫学的重要内容，而应用单克隆抗体对HLA进行位点检查与配型可得到更可信的结果。 4．机体微量成分的测定应用单克隆抗体和免疫学技术，可对机体的多种微量成分进行测定，如诸多酶类、激素、维生素、药物等；对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和治疗均具有实际意义。 上述应用的单克隆抗体属于鼠源性，作为体外诊断试剂是满意的。鼠源单克隆抗体如作为生物制剂应用于人体，则因是异性蛋白可引起过敏反应甚至危及生命。从临床治疗及预防疾病的要求，希望制备出人源性单克隆抗体。目前虽然已有文献报道，通过人－鼠细胞杂交及人－人细胞杂交进行了一些探索，但对这些细胞株培养很不稳定，融合细胞中人的染色体往往呈选择性丢失，以致细胞株难以维持培养。因此制备人源单克隆抗体是目前急待解决的问题。 ②免疫后取出脾脏 脾脏为B细胞集中地 取出脾脏内细胞（无菌条件下操作。） ③PEG介导细胞融合 细胞融合 2 min 加入 PEG ④培养、筛选 融合后的细胞均分在96孔板中 HAT培养基：这一步筛选，主要是筛选出杂合的瘤细胞。 融合后的细胞生长状况 刚融合完成 一个癌细胞与两个脾脏细胞 经数次分裂后 稳定的细胞群落 Juang RH (2003) PEG 脾脏细胞 骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT初步筛选杂合细胞 ELISA 筛选抗体 m m 1 1 1 3 3 3 3 2 m 1 4 3 m 1 2 3 4 2 m m m m 3 4 1 2 m m 4 3 1 m m m m m m 2 2 2 4 4 4 4 3.4.3 单克隆抗体的应用 医学检验试剂：主要用于特异性、敏感性要求高的的实验技术中，如传染病的快速诊断；寻找肿瘤特异性抗原及检测肿瘤相关抗原；免疫细胞抗原检测，等等（主要是利用抗原抗体的特异性反应检测特异性抗原）。 导向治疗：生物导弹或免疫导弹 抗原物质的分离和提纯：亲和层析中作为配体，可筛选特异性抗原物质 * 体外细胞生长增殖过程 * 动物组织取出来后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中，在培养箱中培养。这样的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要更换培养基，称为原代细胞。 * 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。 1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。2、加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 * 大多数细胞株在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况，一是衰老死亡，二是发育