重组人Era蛋白可溶性表达、 纯化及生物学活性测定.doc

重组人Era蛋白可溶性表达、 纯化及生物学活性测定 　作者：吴元明, 张晓楠, 邢小红, 张俊杰, 陈南春, 陈苏民 【摘要】 　　目的: 为了得到可溶性表达的人Era（hEra）蛋白, 并检测其生物学活性。方法: 把人era的cDNA基因从pUC19质粒亚克隆入表达质粒pMALp2x中。pMALhEra转化大肠杆菌TB1, 用异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）诱导表达。 结果: pMALhEra载体表达的融合蛋白是以可溶状态存在, 表达量占菌体总蛋白的23.9%。再利用直链淀粉亲和色谱柱对表达的融合蛋白进行纯化, 接着用因子X将融合部分切除, 但切除后的hEra蛋白不稳定, 随着时间的延长而被降解。活性测定结果表明人Era蛋白能与GTP结合, 并具有GTP酶的活性。结论: 可溶性表达了人Era蛋白, 并用体外实验证实人Era蛋白是一种G蛋白, 这对人era基因的功能研究具有重要意义。 【关键词】 人Era 可溶性表达 生物活性测定 　　[Abstract] AIM: To prepare a soluble human Era(hEra) protein and to measure its bioactivity. METHODS: Human era cDNA gene from pUC19 plasmid was subcloned into the expression plasmid pMALp2x. pMALhEra was transducted to E.coli TB1 and the strain was induced by isopropyl βDthiogalactopyranoside (IPTG). RESULTS: The expressed MBPfused protein existed in a soluble form. The fused protein made up 23.9% of the total cell lysate. It was purified by amylose affinity chromotography and digested with Factor X. Although the fused segment was dissected, the remained hEra protein was unstable in the solution with the passage of time. The activity assay showed that hEra wasa GTPase that could bind GTP and hydrolyze GTP to GDP. CONCLUSION: Human Era protein can be expressed in a soluble form and it has been proved to be a kind of G protein by the experiments in vitro. The study is important to further research into the function of human era gene. 　　[Keywords]human Era; soluble expression; bioactivity assay 　　era基因是1986年在大肠杆菌中发现的, Era与人及酵母的Ras蛋白有部分相似之处,命名为大肠杆菌Ras样（E.coli Raslike）基因[1]。era基因在原核生物中普遍存在, 在真核生物如蠕虫、 小鼠、 人、 植物中也存在与细菌era高度同源的基因。Era蛋白是小G蛋白家族的新成员, 和其他小G蛋白不同的是, 其羧基端含有一个KH结构域。实验发现Era蛋白可以特异地与16SrRNA结合[2], 这可能与其含有的KH结构域有关。Sharma等[3]通过电镜技术在嗜热栖热菌细胞内观察到30S和Era蛋白的复合体, 接着Inoue等[4]又利用细菌突变技术说明Era参与了细菌的核糖体生物合成。era是大肠杆菌中可以正常表达的基因, 但表达水平极低。遗传学实验证实era基因与细胞周期和细胞分裂有关, 是细菌生存繁殖所必需的重要基因。 　　陈苏民等相继克隆了人及小鼠全长的eracDNA基因。人eracDNA基因全长约2.2 kb, 含长度为1038 bp的开放读框, 编码346氨基酸的蛋白质。人Era（hEra）与大肠杆菌Era (eEra)蛋白全序列比较, 有31%相同、 53%相似。同样, hEra也是由N端的GTPase结构域和C端