重组人sCR1真核表达载体构建、 表达及其生物学活性.doc

重组人sCR1真核表达载体构建、 表达及其生物学活性 　【摘要】 目的: 采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体（sCR1）, 研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。方法: 从人外周血中提取总RNA, 应用RTPCR获得人sCR1全长cDNA, 然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中, 构建含人sCR1的重组质粒（pPIC9ksCR1）, 经测序鉴定正确, 电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中, 将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定, 经甲醇诱导, 表达产物经SDSPAGE分析和Western blot鉴定, 通过Ni2+NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。结果: 获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9ksCR1, 经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株, 经甲醇诱导含pPIC9ksCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDSPAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带, 在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体（mAb）识别。经 Ni2+NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。结论: 人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达, 并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。 【关键词】 可溶性补体受体1 毕赤酵母细胞 生物学活性 真核表达载体 补体受体1（complement receptor type l, CR1）又称C3b/C4b受体, 在人白细胞表面被命名为CD35分子, 是最早定型的补体受体, 也是目前所知最重要的一种补体受体。Weisman等[1]于1990年首次研制出缺乏跨膜区和胞内区的可溶性补体受体1（soluble complement receptor type l, sCR1）是CR1细胞外片段。并证明了保留天然CR1已知的所有功能单位, 但丧失信号转导作用, 用于阻断人类疾病对补体不适当激活造成的机体组织损伤, 对治疗和诊断补体介导的自身免疫性疾病、 病毒感染、 肝病、 器官移植排斥反应等疾病中具有广阔的应用前景和较高的经济效益。因此, 运用基因工程方法构建真核表达sCR1, 具有一定的研究和应用价值。毕赤酵母菌（pichia pastoris）是一类常用的基因工程及工业表达体系, 具有高生物菌体产量、 强启动子、 高分泌效率、 有一定的蛋白质翻译后加工, 有利于真核蛋白的表达等优点, 便于进行高密度培养和放大发酵规模。目前人们已利用毕赤酵母系统成功表达了许多外源蛋白[2, 3]。为了下一步研究sCR1用于补体介导的自身免疫性疾病、 病毒感染、 肝病、 器官移植排斥反应等疾病诊断和治疗的可能性, 我们从人全血中克隆获得的全长cDNA, 并在毕赤酵母中进行了表达和生物学活性鉴定。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　巴斯德毕赤酵母细胞SMD1168(Pep4△his4)、 酵母分泌型表达载体pPIC9K由福州总医院全军检验中心杨湘越主任技师惠赠; 表达于大肠杆菌BL21（DE3）中的重组PET28asCR1质粒, DH5α为本室保存; RNA全血抽提试剂盒购于QIAGEN公司; 逆转录酶购于Promega公司; 胶回收试剂盒购自博日科技有限公司; 3S柱离心式酵母基因组制备试剂盒购于申能博彩生物科技有限公司; Pyrobest高保真DNA聚合酶、 各种限制性内切酶、 T4连接酶、 DNA marker DL 2000、 1000 bp DNA Ladder marker、 蛋白marker、 蛋白预染marker均购自TaKaRa公司; 引物合成及核苷酸序列均由上海英俊生物技术有限公司和上海生工生物工程技术有限公司测定; 溴化乙锭（EB）、 生物素、 酵母氮碱（YNB）干粉、 D山犁醇等均购自上海生工生物技术有限公司; Ni2+NTA agarose购自QIAGEN公司; BCA法测定蛋白试剂盒购自Pierce公司; G418（氨基糖苷类抗菌素）购于太阳马生物工程有限公司; 鼠抗人CD35 mAb、 辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG均购于晶美公司; 绵羊红细胞溶血素购于浙江省玉环县南方试剂厂; 其他所用试剂均为国产或进口分析纯; YPD、 BMGY、 BMMY和MD培养基均按Invitrogen公司的毕赤酵母菌实验操作手册配制; PE2400型DNA扩增仪为ABI公司产品; 电转杯、 电击仪、 Trans blot电转印仪及FluorSTM Multilmager凝胶成像系统均为BioRad公司产品。 　　1.2