重组细小病毒对胶质瘤细胞生长抑制作用.docVIP

重组细小病毒对胶质瘤细胞生长抑制作用 　【摘要】 　　［目的］ 研究表达趋化因子MIP-1α/LD78β的重组细小病毒对胶质瘤细胞的生长抑制作用。［方法］ 共转染法制备重组病毒。用重组病毒感染人胶质瘤细胞系U87MG以及鼠胶质瘤细胞系GL261，监测细胞生长并用ELISA方法测定细胞培养上清中MIP-1α蛋白每日和累积表达量。克隆形成实验测定病毒的细胞毒性。［结果］ 与未处理的细胞相比，MOI=3 RU/cell的重组病毒感染使GL261细胞克隆形成减少。U87MG和GL261细胞感染重组病毒后均可产生大量MIP-1α蛋白。日表达量的高峰分别出现在感染后第3d和第4d。2×105的 GL261和U87MG细胞在感染（MOI=3）5d后累积蛋白表达量分别为780ng/ml 和250ng/ml。和对照相比，重组病毒感染的GL261细胞生长减慢，但表达MIP-1α或LD78β的重组病毒与不含外源基因的重组病毒感染GL261后，活细胞数目没有明显差异。U87MG对病毒的敏感性低于GL261，感染重组病毒的各组细胞生长比对照略缓慢。［结论］重组细小病毒在体外对U87MG和GL261胶质瘤细胞的生长有抑制作用，但转导外源基因MIP-1α/LD78β在体外对细胞生长无明显影响，抑制作用主要是由于病毒的细胞毒性引起。 【关键词】 重组细小病毒　胶质瘤细胞　细胞毒性　生长抑制 　　 Growth Inhibition of Glioma Cells after Infection with the Recombinant Pavoviruses 恶性胶质母细胞瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，常规的治疗方法远不能达到治疗要求。趋化因子可吸引免疫效应细胞至病灶部位，并激活机体免疫反应，可作为肿瘤基因治疗的侯选基因[1]。巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)属于CC趋化因子家族，其主要作用是吸引单核细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK）等。LD78β是MIP-1α的异构体，趋化活性较MIP-1α强[2]。我们前期的研究表明人胶质瘤细胞系U87MG以及鼠胶质瘤细胞系GL261可作为细小病毒治疗胶质母细胞瘤的细胞模型进行深入研究[3]，本研究测定了表达MIP-1α/LD78β的重组细小病毒在体外对U87MG和 GL261的细胞毒性和生长抑制作用，并测定了外源蛋白在细胞中的表达量，为下一步在动物体内研究其抗肿瘤作用作准备。 1 材料与方法 1.1 材 料 细胞系：人胶质瘤细胞系U87MG以及鼠胶质瘤细胞系GL261，指示细胞 NBE-324K 和A9为德国癌症研究中心肿瘤病毒学研究室赠送。 MVM和H1重组病毒质粒hH1/MIP-1α，hH1/LD78β和hH1/Δ800，MVMp/MIP-α，MVMp/LD78β，MVMp/Δ80及包装质粒和野生型病毒：德国癌症研究中心肿瘤病毒学实验室Dr. Rommelaere赠送。其他细胞为本室保存。 1．2 方 法 1.2.1 细胞培养 293T、GL261和U87MG细胞在含10%小牛血清、2mM L-谷氨酸和抗生素的DMEM中培养，A9和NBE-324K在10%小牛血清，2mM L-谷氨酸和抗生素的MEM中培养。培养条件为37℃，5% CO2，90%湿度。 1.2.2 重组病毒制备 培养1×108 293T细胞，磷酸钙法转染300μg H1( hH1/MIP-1α，hH1/LD78β和hH1/Δ800)和MVM重组病毒质粒，(MVMp/MIP-α，MVMp/LD78β，MVMp/Δ800)及其相应的600μg包装辅助质粒，72h时后收获细胞, 冻融法制备病毒粗提物，碘克沙醇（iodixanol）梯度离心纯化，病毒分别感染SV40转化的人胎肾细胞系NBE-324K和鼠成纤维细胞A9，用病毒DNA特异性探针杂交测定H1和MVM重组病毒的感染滴度（replication unit，RU/ml）。 1.2.3 病毒感染和生长曲线 感染的前一天在6cm细胞培养皿中培养2.5×105细胞，次日吸除培养液，加入0.4ml用不含血清的MEM稀释的病毒，病毒剂量为multiplicity of infection(MOI)=3，置于37℃，5% CO2，90%湿度孵箱，每隔10min轻轻摇动培养皿1次，以确保细胞与病毒的接触。1h后吸除病毒，加入4ml含10%血清的培养液培养5d，每天取出2盘细胞用台盼蓝染色计数，绘制生长曲线。 1.2.4 克隆形成实验测定病毒的细胞毒性 在6cm 细胞培养皿中培养2.5×105 GL261细胞，次日进行病毒感染，病毒剂量为MOI=3，感染1h后吸除病毒，加入4ml含10%血清的培养液培养4h，用胰酶消化细胞并计数，在新的培养皿中分别加入100、500、1000、